文 / Katrin T?pner & Dr Dirk Hansen& Dr Elmar Herbig

適用于HPLC-SEC分析的超純水 // 高效液相色譜（HPLC）是一種進行物質分離、鑒定和定量的分析方法。與其它通常采用梯度模式的各種生物聚合物HPLC（離子交換、疏水相互作用和反相色譜）不同，SEC（尺寸排阻色譜法）通常采用等度方法。

尺寸排阻色譜法

尺寸排阻色譜法（SEC）包括凝膠滲透色譜法（GPC）和凝膠過濾色譜法（在含水條件下實行的一種特殊SEC法），是利用球形顆粒多孔基質作為固定相的一種分析方法。小分子能夠滲透到篩孔中并被截留。與此相反，大分子則不能進入篩孔，只能以線性流速通過色譜柱。因此，分子根據其大小進行分離，大分子先從色譜柱中洗脫出來，而后才是小分子從色譜柱中洗脫出來。

SEC是一種常用于生物聚合物的分離方法。目前的應用領域如下：

測定分子量，例如抗體（免疫球蛋白G，（見圖1），肽和蛋白質）

作為一個研究構象變化的工具用于下游加工（后續(xù)加工和產品凈化）。

特殊應用：用于肽和蛋白質混合物的自動化樣品制備的SEC限制介入色譜柱。

圖1 免疫球蛋白G（IgG抗體；圖片由Sartorius提供）

幾十年來，生物制藥在醫(yī)藥市場上已經占據了重要地位。在這些生物制藥產品中，有醫(yī)藥用酶、凝血因子、各種激素——如胰島素、依泊汀或生長激素、單克隆抗體（mAbs）和生物工程疫苗。

SEC分析是下游加工中的標準方法，用于通過重組生產治療性蛋白質和抗體來確定生物制造期間靶分子的純度和聚集狀態(tài)。

確定分子量間的差異來檢測污染物和聚合物是基于高純洗脫液的使用，高純洗脫液不會與固相發(fā)生任何反應。

SEC所需特殊質量的水可以從各個制造商處購買，或者直接使用arium?pro VF等實驗室純化水系統(tǒng)在現(xiàn)場按需直接制備。

水的實驗評估

本文對重組單克隆抗體進行了定性研究，作為SEC分析使用的一個例子。所使用的解決方案源于我們的內部方案。

圖2 當前的arium?pro VF超純水系統(tǒng)（照片由Sartorius提供）

在上游加工（溶液制備）期間，發(fā)酵培養(yǎng)基（宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質、培養(yǎng)基成分，如白蛋白、胰島素和轉鐵蛋白）以及微生物和內毒素產生的雜質和污染物必須在下游加工中減少。這一過程也是雜質的來源（蛋白酶的加入，蛋白A的泄漏）。mAb產物本身也能形成雜質，例如分裂的或聚集的抗體，mAb的脫酰胺或氧化形式或錯誤折疊分子，對此必須進行檢測。

對于靶蛋白純度的質量控制，根據其分子量分離，采用SEC等方法來檢測聚集的抗體。

實行初步測試來檢測這些操作中使用的超純水是否適合用于SEC分析。如[原位雜交 - 超純水對RNA技術的重要性]中所述制備超純水，并將其用于這些初步試驗和進一步確定單克隆抗體聚集狀態(tài)的測試。

初步試驗旨在說明arium? pro VF（上一代型號，同圖2所示當前系統(tǒng)生產超純水的技術規(guī)格相同）是否可以用于SEC分析，檢測單克隆抗體的聚合物和單體。此外，測試了多種緩沖物質的作用。

在測試系列中采用了以下物材料（見表1）：

所使用的色譜柱是Phenomenex Yarra SEC 3000 （3 μm），是用改性硅填充的SEC色譜柱。新一代超純硅膠的改性確保了最低限度的蛋白質吸附，這對于實現(xiàn)高效的回收率和可靠的定量分析至關重要。Yarra色譜柱使用了孔徑為290 ?的填料,從而使天然蛋白質的線性范圍在5 kDa和700 kDa之間。

在加入或不加入緩沖物質的情況下來確定超純水的純度。加入的緩沖物質如下所示：

TE緩沖液= 1% 1 M Tris-（羥甲基） - 氨基甲烷（TRIS），0.2%0.5M乙二胺四乙酸（EDTA），0.01%十二烷基硫酸鈉（SDS），pH 8，電導率1.4 mS/cm

表1材料

表2 SEC-HPLC 方法

Citrate = 20 mM citric acid monohydrate, pH 3.6, conductivity 1.7 mS/cm

檸檬酸鹽= 20 mM 一水檸檬酸，pH 3.6，電導率1.7 mS/cm

磷酸鈉/硫酸鈉= 0.1M 磷酸鈉/硫酸鈉，pH 6.6，電導率23mS/cm，以及arium? ultrapure water without any buffer additives,for use as a controlarium?超純水，不添加任何緩沖添加劑，用于對照。

SEC的分析色譜圖如圖3所示，同時也顯示使用的超純水與固定相之間沒有任何相互作用。流動相中加入0.1 M磷酸鈉/硫酸鈉后，同樣顯示一條沒有峰值的直線基線。與此相反，檸檬酸和TE的增加表明了存在與色譜柱基質產生作用的污染物或物質（圖中峰值部分），并因此能扭曲真實的色譜圖。

試運行的結果表明，arium?VF超純水可用于制備洗脫液的緩沖物質的溶劑，然后對樣品進行實際分析。

為了在SEC分析中獲得可重現(xiàn)的結果，必須使用新鮮制備的洗脫液。對于待分析的樣品，需要優(yōu)化洗脫液的pH和離子強度。在保存色譜柱前，應先用洗脫液沖洗，然后用含0.05%疊氮化鈉的超純水沖洗，并在此條件下進行保存。

色譜柱用的流動相（0.1 M磷酸鈉/0.1M硫酸鈉，pH 6.6，電導率23 mS/cm）用超純水制備（超純水的原電導率為0.055 μS/cm或18.2 MΩ（兆歐姆)，補償至25 °C）。SEC-HPLC使用表2中列出的設置/參數(shù)操作。為了防止細菌生長，使用含0.05%疊氮化物溶液的超純水來清洗和儲存色譜柱。為了制備用于HPLC-SEC操作的兩種溶液，使用Sartolab BT 500 Bottle Top 0.2 μm真空過濾裝置來過濾脫氣。通過Sartorius Minisart? RC4（17821,0.2 μm）預先過濾并將其填充在小瓶（WICOM WIC 42000）中來制備要注射的樣品。

圖3 各種緩沖液和arium?pro VF超純水的HPLC-SEC分析。流動相：0.1 M磷酸鈉/硫酸鈉，pH 6.6，電導率23 mS/cm，在超純水中（表2中所述條件）。

圖4 蛋白質混合物（標準蛋白質）的HPLC-SEC分析（條件列于表2中）。

單克隆抗體聚集狀態(tài)確定的測試程序和結果

色譜柱和預置柱用流動相以1 mL/min的速度進行洗滌，直到達到穩(wěn)定的基線。UV檢測器測量樣品在220，260和280 nm波長的吸光度（單位為毫安吸光度（mAU））。使用已知分子尺寸的蛋白質檢查色譜柱的性能（見圖4和表3）。

標準曲線可根據標準蛋白的對數(shù)分子大小和確定的截留時間進行繪制。利用這條曲線可以用根據截留時間來計算未知樣本。

色譜柱的性能可使用標準蛋白質混合物進行定期檢查。該性能受洗脫液中添加劑的純度、洗脫液與色譜柱基質的相互作用以及所分析樣品組分的影響。所使用的緩沖液可能與固定相之間完全不起任何相互作用。

SEC分析可用于質量控制，也可用于純化工藝的優(yōu)化和開發(fā)。

下文說明了在下游工藝過程中記錄的SEC色譜圖。單克隆抗體在一系列連續(xù)的步驟中被純化。首先實行細胞收獲、澄清和濃縮步驟，然后實行捕獲步驟（蛋白A親和層析）。然后，實行中間步驟除去污染物（例如陽離子交換劑），然后實行拋光步驟即完成（陰離子交換劑）。隨后，進行病毒過濾和最終超濾。

為了確定抗體的純度，在下游加工期間在SEC色譜柱中運行樣品。在細胞收獲（圖5）和蛋白質A親和層析（圖6）的初步澄清后，樣品運行的色譜圖如下所示：

表3 使用的標準蛋白質

細胞收獲（圖5）的初步澄清后的HPLC分析運行顯示了許多污染物，如宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質、內毒素、培養(yǎng)基組分和抗體產物本身引起的雜質以及聚合物，這些污染物需要在隨后的下游加工步驟中去除。

圖5 細胞收獲后的單克隆抗體的HPLC-SEC分析和下游加工期間的初步澄清（條件列于表2中）。

圖6 蛋白質A親和層析后的單克隆抗體的HPLC-SEC分析和下游加工期間的初步澄清（條件列于表2中）。

在下面的步驟中，使用了蛋白質A對免疫球蛋白G（IgG）的特殊親和性。在該步驟中使用了Sartobind?蛋白A（93PRAP06HB-12-A）吸附劑。在初步澄清之后（參見圖5的分析），樣品通過蛋白A單元過濾。IgG與蛋白A吸附劑結合，而污染物則通過了吸附劑。蛋白A的洗脫可以通過HPLC-SEC分析進行檢查（參見圖6）。

通過蛋白A親和層析試驗分析的洗脫樣品表明了單克隆抗體的顯著純化效果。聚合物和污染物的百分比顯著降低。采用HPLC-SEC分析的流出組分顯示了兩個峰值（圖6）?；诟髯缘慕亓魰r間，這些峰值可以使用標準值以分子大小進行計算。獲得的峰值面積提供了關于mAb溶液中聚合物和單體的百分比信息（表4）。

收獲和初步澄清（圖5）后，對mAb聚合物和單體的百分比實行的SEC分析表明污染mAb的10%聚合物仍然存在（表4）。SEC分析實驗表明（在使用蛋白質A親和層析的額外純化步驟后），聚合物的百分比下降至3%（圖6）。SCE分析未再檢測到更多污染物。所獲結果清楚表明使用的這種方法是合適的。

表4 使用的標準蛋白質

總結

HPLC-SEC分析是確定治療性蛋白質純度的重要工具，并且在全世界范圍內用作測量聚合物含量和污染物百分比（單克隆抗體制造過程）的標準方法。

鑒于蛋白質的完整性——在這種情況下，單克隆抗體由于溫度變化、機械應力影響、pH波動和生產過程中以及整個生命周期中的紫外線照射的影響而受到威脅，因此，建立確定單克隆抗體純度的可靠方法是至關重要的。

本文所述的方法能夠很好地確定單克隆抗體的聚集狀態(tài)。此外，它表現(xiàn)出了優(yōu)秀的凈化效果。實施這種方法的基本先決條件是所使用物質和溶液的純度，特別是用于制作溶液的基本溶劑所采用的水。如初步試驗（圖3）所示，由arium?pro VF生產的超純水適合作為溶解緩沖物質和鹽的介質，進而制備SEC使用的流動相。

使用 arium? 超純水時，沒有檢測到流動相和固定相相互作用而產生的假峰，也沒有檢測到紫外線活性污染物或峰位移。以高TOC值形式表示的強有機雜質可能表現(xiàn)在峰位移中，因為隨著試驗進行，色譜柱基質變得更加非極性。重金屬鹽或螯合劑可以屏蔽色譜柱中的電荷，而這可能導致蛋白質折疊（增加抗體聚合物的形成）。這些假設必須在進一步的實驗中予以澄清。