文/Denise Wallworth & Hugh Cramer & David S. Bell &田海玉

利用手性色譜與質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)精神藥物安非他明和甲基安非他明進(jìn)行生物檢測 // 甲基安非他明和安非他明是強(qiáng)效中樞神經(jīng)興奮劑，在使用方面有許多道德問題：會(huì)對(duì)提高信心、增加社交性和能量方面產(chǎn)生副作用，如作為娛樂精神藥物被過分使用。由于其對(duì)提高精神警覺性和抑制疲勞具備增強(qiáng)作用，導(dǎo)致體育領(lǐng)域藥物濫用，會(huì)引起高血壓和心動(dòng)過速等副作用。安非他明的副作用要小于甲基安非他明，但在不受控制的藥物濫用情況下，兩者產(chǎn)生的效果非常類似。

目前，這些藥物濫用程度依然非常高。英國公共衛(wèi)生部報(bào)告指出，2012年注射藥物安非他明和安非他明類物質(zhì)的人數(shù)是2002年的幾乎3倍之多。另外，與揮發(fā)性較弱的硫酸安非他明不一樣，鹽酸安非他明（亦稱“冰”和“冰毒”）可以被吸食，這方面與可卡因類似，但效果持續(xù)時(shí)間更長。據(jù)報(bào)道，通常情況下，不會(huì)對(duì)安非他明和甲基安非他明進(jìn)行共同的常規(guī)檢測，因此哪種藥物使用更廣泛的信息少之又少。需要注意的是，在亞洲和北美，甲基安非他明比安非他明更容易獲取，在歐洲，則反之。

手性

安非他明和甲基安非他明都是手性分子（如圖1）。一般情況下，兩種藥物的D型異構(gòu)體比L型異構(gòu)體的生物活性更強(qiáng)。盡管甲基安非他明是受控制物質(zhì)，其L型異構(gòu)體事實(shí)上用于幾種非處方藥中（如北美的吸入制劑Vicks?），在一定程度上會(huì)改變藥物濫用所引起的真實(shí)水平的提升。事實(shí)證明，L-甲基安非他明也是幾種治療性藥物的代謝產(chǎn)物，如司立吉林（早發(fā)性帕金森氏癥、抑郁和癡呆的治療藥物）。安非他命的定量既復(fù)雜又簡單（甲基安非他明的主要代謝產(chǎn)物）。傳統(tǒng)的藥物分析方法：免疫測定法，并不能區(qū)分異構(gòu)體，很容易給出不完整和不確定的結(jié)果。

圖1 安非他明和甲基安非他明手性異構(gòu)體結(jié)構(gòu)示意圖

非法出售甲基安非他明，通常是D型異構(gòu)體或消旋體。根據(jù)純度和異構(gòu)體組成，一個(gè)當(dāng)量的產(chǎn)品可被吸收的藥物量從幾十毫克到幾百毫克不等，并代謝為安非他明和4-羥基甲基安非他明。安非他明代謝物主要是1-苯基-2-丙酮，其次為4-羥基安非他明。然而，口服攝入后，高達(dá)54%的甲基安非他明和10-23%的安非他明被排出，這通常是被監(jiān)測的母體藥物。

確定非法使用安非他明和甲基安非他明的罪責(zé)，在于能夠區(qū)分對(duì)被測濫用產(chǎn)品的貢獻(xiàn)和L-對(duì)映體的可能替代來源。因此，對(duì)于檢測來說，將對(duì)映異構(gòu)體分離開來是更精確的方式。手性分離方法也可以用來指示非法來源所使用的合成路線，有助于刑事調(diào)查。

圖2. 不同流動(dòng)相添加劑條件下甲基安非他明手性異構(gòu)體分離示意圖

圖3 不同濃度流動(dòng)相添加劑條件下甲基安非他明信噪比

分析方法開發(fā)

因其更大的靈活性，可滿足化合物毒理學(xué)研究需求，LC/MS/MS方法正逐漸成為分析方法的首選。另外，包括手性GC方法和手性LC方法都可用于生物檢測。

GC方法不可避免包括這些類型分子的衍生化，通常作為三氟醋酸鹽在手性GC固定相上進(jìn)行分離。通常來講，HPLC的樣品前處理和方法開發(fā)相對(duì)來說更簡單一點(diǎn)，更適合生物樣品的分析。本文開發(fā)HPLC分析方法，并對(duì)分辨率、保留和LOQ進(jìn)行優(yōu)化。

HPLC方法開發(fā)

Astec? CHIROBIOTIC?HPLC手性固定相（CSPs）基于鍵合的大環(huán)糖肽，具備良好的質(zhì)譜兼容性，且對(duì)極性分子適用性強(qiáng)，因此選擇此類色譜柱進(jìn)行方法開發(fā)。另外，在臨床和司法應(yīng)用方面，Astec CHIROBIOTIC CSPs的優(yōu)勢在于穩(wěn)定性和耐受生物樣品的能力，而其他的CSPs無法承受如此的條件。Astec CHIROBIOTIC CSPs在反相和極性離子流動(dòng)相（有機(jī)改性劑與水占比＞90%，離子添加劑比例＜10%）條件下，均可表現(xiàn)出手性選擇性。

甲基安非他明通過反相和極性離子流動(dòng)相兩種模式進(jìn)行分離，后者表現(xiàn)出更強(qiáng)的選擇性（添加劑包括醋酸/氫氧化胺和三氟乙酸胺，均進(jìn)行優(yōu)化）。

極性離子固定相分離模式的經(jīng)典選擇是100%有機(jī)相，尤其是非水流動(dòng)相，除此之外，可以添加最多10%水（保證分離模式不轉(zhuǎn)換為反相模式），進(jìn)行分離。在極性離子分離模式下，添加劑通常是一種酸、堿和揮發(fā)性鹽，作用是增強(qiáng)CSP可離子化表面的離子作用力，同時(shí)有助于質(zhì)譜中分析物離子化的穩(wěn)定性。在此種分離模式中添加至多10%的水，有助于提高離子添加劑的溶解性，保證分析方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

相對(duì)于所有的手性固定相，Astec CHIROBIOTIC的分離機(jī)理更像是混合模式。大環(huán)糖肽表面包含許多可能的作用位點(diǎn)，如亞胺（多肽）、苯酚、離子（氨基或羧基）和芳香氯基團(tuán)，以及絡(luò)合空腔。Astec CHIROBIOTIC V2采用萬古霉素作為手性鍵合相，其含有羧基，因此適用于一些亞胺類分子的分離。其他功能基團(tuán)通過氫鍵作用來增強(qiáng)分離效果。

圖4 甲基安非他明異構(gòu)體在Astec CHIROBIOTIC V2色譜柱上的手性LC/MS分析結(jié)果

圖5. 在Astec CHIROBIOTIC V2色譜柱上對(duì)甲基安非他明和安非他明燈四種異構(gòu)體進(jìn)行手性LC/MS分析

甲基安非他明異構(gòu)體的分離檢測

一根Astec CHIROBIOTIC V2（15 cm × 4.6 mm, 5 μm）色譜柱在兩種極性離子流動(dòng)相條件下對(duì)比保留和分辨率。兩種條件均是甲醇：水=95：5。第一種流動(dòng)相采用醋酸和氫氧化銨（0.1：0.02）作為離子添加劑。第二種采用三氟醋酸銨。兩種條件下，均取得了基線分離，D-或 S（+）異構(gòu)體先于L-或 R（-）異構(gòu)體流出。三氟醋酸銨作為離子添加劑條件下，保留和分辨率均較低。

稍后對(duì)兩種離子添加劑條件下的檢測靈敏度作比較。經(jīng)過對(duì)比信噪比，采用醋酸/氫氧化銨作為添加劑可獲得更低的定量限（＜12.5 ng/mL），因此選擇該流動(dòng)相體系作為優(yōu)化后的檢測條件。建立定量曲線，R(-)-甲基安非他明在12.5到240 ng/mL之間是線性相關(guān)的。將相同的色譜條件用于安非他明的檢測，同樣取得高分辨率，保留弱于甲基安非他明。

同時(shí)分析安非他明和甲基安非他明

盡管這些化合物的重要性不一，尋找能夠同時(shí)對(duì)這四種異構(gòu)體進(jìn)行基線分離的方法依然很重要。采用前面優(yōu)化好的色譜分析方法對(duì)四種異構(gòu)體進(jìn)行分析，其中兩種物質(zhì)共流出。雖然質(zhì)譜檢測器可以有效識(shí)別出這些交叉色譜峰，依然對(duì)分析條件進(jìn)行優(yōu)化。研究酸/堿比例對(duì)分辨率的影響，以及將CHIROBIOTIC V2換成CHIROBIOTIC V（鍵合相一致，鍵合化學(xué)有差異）所造成的影響。但是，這些優(yōu)化均未能實(shí)現(xiàn)四種異構(gòu)體的基線分離。通過簡單的增加色譜柱長度和提高分析溫度，成功實(shí)現(xiàn)四種異構(gòu)體的基線分離。

樣品制備的重要性

有效的樣品制備可以去除基質(zhì)干擾，提高分析方法的靈敏度和穩(wěn)定性。如下是液液萃取LLE和固相萃取SPE分別應(yīng)用在尿液中萃取甲基苯丙胺的方法對(duì)比。

液液萃取LLE

125μL尿液中加標(biāo)甲基安非他明（異構(gòu)體濃度均為125ng/mL）和1mL二乙醚。渦旋震蕩30分鐘后，10000轉(zhuǎn)離心機(jī)離心10分鐘，取上層有機(jī)溶液500μL, 55℃氮吹至干，500μL流動(dòng)相復(fù)溶，0.22PVDF濾膜過濾，上樣分析。

圖6 經(jīng)過液/液萃取或Supel-Select SCX固相萃取處理后，對(duì)尿液中的甲基安非他明進(jìn)行手性LC/MS分析

附錄

圖7 通過注射泵將兩種不同級(jí)別的乙腈直接注射入MS系統(tǒng)

固相萃取SPE

SPE方法中，1mL尿液中加標(biāo)甲基安非他明（異構(gòu)體濃度均為25ng/mL），甲酸調(diào)pH 3-4。使用Supel?-Select SCX SPE 96孔板 (30 mg/well，575664-U)，1 mL 1%甲酸的乙腈溶液和1 mL純水先后預(yù)處理96孔板，加入1 mL尿樣。依次用2 mL水、1 mL 25%甲醇淋洗。用1 mL 5mM磷酸氫二胺的50%甲醇溶液清洗苯甲胺，最后用1 mL 10%氫氧化銨的乙腈溶液洗脫目標(biāo)化合物。40℃氮吹至干，1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，備用。

如圖6所示，對(duì)比液液萃取LLE和固相萃取SPE的分析結(jié)果，SPE法得到的萃取液更為干凈，去除了幾乎所有基質(zhì)的干擾，提高了目標(biāo)分析物的回收率。

溶劑

溶劑等級(jí)不同，其所含有的雜質(zhì)含量不同， LC-MS分析時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的基線背景和噪音，影響檢測的靈敏度。為保證高靈敏度的LC/MS分析，需采用高級(jí)別的溶劑（參考圖 7）。

結(jié)論

Astec CHIROBIOTIC V2以萬古霉素作為固定相可以為甲基安非他明和安非他明等四種手性異構(gòu)體提供快速和基線分離的分析方法。采用極性離子流動(dòng)相模式，在甲醇/水體系中加入醋酸/氫氧化銨，可以為安非他明和甲基安非他明提供靈敏和高通量的手性分離方法。該方法具備低LOQ和高分辨率等優(yōu)點(diǎn)。采用Supel-Select SCX SPE進(jìn)行樣品前處理可以去除掉尿液基質(zhì)中的復(fù)雜干擾物。而且該樣品前處理和LC/MS分析方法易于轉(zhuǎn)移。