羅金蓮，余澤波，王 靜，李 青，闕文君，胡 雪，詹廷西

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科， 重慶 400016)

干細胞(stem cells)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞。自我更新是指干細胞分裂產(chǎn)生至少1個具有干細胞特性子細胞的過程。分化潛能是指未分化的干細胞在一定條件下可分化為各種類型的細胞。自我更新能維持干細胞具有多分化的潛能。對于組織特異性干細胞而言，自我更新是維持其終生具有分化潛能的基礎(chǔ)[1]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早發(fā)現(xiàn)于骨髓，同時也存在于其他組織中，如脂肪組織和臍帶等。MSCs增殖與分化的平衡決定其最終歸宿：平衡狀態(tài)下，MSCs發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪或其他類型的細胞；失衡狀態(tài)下，則可能發(fā)生骨肉瘤等骨病變。因此，明確MSCs增殖與分化的調(diào)控機制，對于骨肉瘤治療和骨組織工程發(fā)展等都具有重要意義。

近年來，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)對MSCs干性維持及多向分化的調(diào)節(jié)作用受到越來越多的關(guān)注。LncRNA是一類長度大于 200個核苷酸的非編碼 RNA，曾被認為是無作用的轉(zhuǎn)錄“噪聲”。然而，隨著生物信息學(xué)和測序技術(shù)進步，越來越多的證據(jù)表明，LncRNA可能在許多生理病理過程中起著重要的調(diào)控作用，如干性維持和細胞分化、細胞周期調(diào)控、基因組印記、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、腫瘤增殖遷移等。本研究通過分析國內(nèi)外相關(guān)文獻，就LncRNA在MSCs干性維持、多向分化及成瘤中的功能及相關(guān)機制進行綜述。

1 LncRNA與MSCs干性維持的關(guān)系

MSCs的干性維持包括兩個方面：自我增殖能力和分化全能性或多能性，即在合適條件下，MSCs能一直傳代下去，而且分化全能性保持不變。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)：LncRNA是MSCs轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，對維持MSCs多向分化潛能起著關(guān)鍵作用。Sheik 等通過對小鼠ESCs全基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，尋找與ESCs干性維持相關(guān)的LncRNA。他們發(fā)現(xiàn)LncRNA AK028326是Oct4的直接靶標，在調(diào)節(jié)反饋環(huán)中共激活Oct4。LncRNA AK141205是Nanog的直接靶標，可抑制Nanog活性。通過實驗進一步證明了這些LncRNA不僅是由mESC人轉(zhuǎn)錄因子控制，而且LncRNA本身就可以調(diào)控mESC發(fā)育狀態(tài)[1]。Wang等[2]報道：linc-RoR在人類胚胎干細胞(hESCs)的分化過程中表達急劇下降，linc-RoR可能作為競爭性內(nèi)源RNA (ceRNA)調(diào)控Oct4、 Sox2和 Nanog的表達。Kretz等[3]的研究表明：LncRNA DANCR (anti-differentiation ncRNA， DANCR) 在細胞分化過程中表達急劇下降。Zhu等[4]的研究表明：DANCR可通過與 enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) 相互作用，抑制Runx2表達，從而使細胞停留在未分化狀態(tài)。Jia等[5]則發(fā)現(xiàn)：下調(diào)DANCR可能通過經(jīng)典Wnt 信號通路促進牙周膜MSCs的增殖和成骨分化。這些研究均提示DANCR在維持細胞干性方面起著重要作用，并且表明多種LncRNA在細胞干性維持方面起著重要的調(diào)控作用。

2 LncRNA 與MSCs分化的關(guān)系

2.1 與MSCs成骨分化相關(guān)的LncRNA

骨形成是一個非常復(fù)雜的過程，同一祖細胞在眾多因素的作用下分化成為不同類型的骨組織。目前對成骨過程中LncRNA發(fā)揮的作用所知甚少，一些研究者對其進行了積極的探索。

Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2) 蛋白在成骨細胞的分化和骨形成方面起重要的作用。Zhu和Jia[4]的研究表明：DANCR可通過與EZH2 相互作用，抑制Runx2表達，從而阻礙成骨分化；下調(diào)DANCR則可促進MSCs的增殖和成骨分化[5]。

LncRNA H19和胰島素樣生長因子2(IGF2)是連鎖交互印跡的基因,二者對細胞的增殖發(fā)揮重要的調(diào)控作用。IGF2和H19的印跡控制區(qū)由差異甲基化區(qū)(differentially methylated regions，DMR)、印跡控制區(qū)(imprinting control region，ICR)和增強子共同調(diào)節(jié)[6-7]。最近已證實，H19基因外顯子還編碼一個微小RNA(microRNA,miRNA)分子 miR-675[8]，而H19編碼的miR-675可通過TGFβ/Smad/HDAC通路促進了成骨分化[9]。另一方面，有研究表明：H19可以作為競爭性內(nèi)源RNA (competing endogenous RNA,ceRNA)活化Wnt信號通路，從而促進成骨分化[10]。筆者所在課題組前期的研究成果也表明：H19是BMP9信號通路重要的調(diào)控因素，H19可以通過調(diào)節(jié)Notch信號通路相關(guān)的miRNAs而影響成骨分化[11]。let7 miR家族已被證明是骨形成的正向調(diào)節(jié)因子， H19可以作為let-7的分子海綿調(diào)節(jié)let7的表達，使let-7的靶基因HGMA2和Dicer在蛋白水平表達上調(diào)。

Berdal等確定了一種與Msx1基因相對應(yīng)的LncRNA Msx1-as。Msx1基因在牙齒和顱面發(fā)育中具有重要作用。Msx1-as可以負性調(diào)控Msx1基因的轉(zhuǎn)錄水平，降低Msx1蛋白水平。此外，Msx1-as還可調(diào)控Msx1蛋白在細胞內(nèi)的定位，抵消Msx1對Dlx5的抑制[12-13]。

Babajko等[14]發(fā)現(xiàn)：lncRNA-LALR1通過激活Wnt/β-catenin信號通路，加速了小鼠肝細胞增殖和細胞周期進程。激活的β-catenin可抑制HOTAIR的表達[15]。Carrion等[16]發(fā)現(xiàn):敲除人主動脈瓣膜間質(zhì)細胞中的HOTAIR可增加成骨相關(guān)基因如堿性磷酸酶(ALPL)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2) 的表達。HOTAIR還可通過調(diào)節(jié)miR-17-5p和它的靶基因SMAD7，在調(diào)節(jié)成骨分化和增殖中扮演重要角色[17]。

Xu等[18]研究了LncRNA (hypoxia-inducible factor 1α-anti-sense 1，HIF1α-AS1)在BMSCs成骨分化中的重要作用。通過TGF-β抑制SIRT1的表達，可上調(diào)HIF1α-AS1，促進BMSCs成骨分化。炎癥微環(huán)境能減弱BMSCs成骨分化的能力。Cui等[19]發(fā)現(xiàn)：沉默LncRNA NONHSAT009968可改善葡萄球菌A蛋白抑制的成骨分化。Li等[20]以成骨生長肽刺激鼠MSCs，證明LncRNA AK141205通過對啟動子區(qū)域內(nèi)H4組蛋白的乙?；瘉泶龠MCXCL13表達，從而促進MSCs成骨分化。

表1為與MSCs成骨分化相關(guān)的LncRNA。

表1 與MSCs成骨分化相關(guān)的LncRNA

2.2 與MSCs成脂分化相關(guān)的LncRNA

PPARγ是脂肪生成的重要調(diào)控因子。Xu等[21]發(fā)現(xiàn)：在脂肪生成過程中，類固醇受體RNA激活物(steroid receptor RNA activator,SRA)的長鏈非編碼RNA形式(LncRNA SRA) 通過與PPARγ共激活PPARγ依賴的受體基因表達，對前脂肪細胞的分化發(fā)揮重要作用。Sun等[22]比較分析了原代棕色和白色脂肪細胞、前脂肪細胞和培養(yǎng)脂肪細胞的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了175種在脂肪生成過程中受到調(diào)控的LncRNA。這些LncRNA多數(shù)通過調(diào)節(jié)脂肪生成的重要調(diào)控因子如PPARγ、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白 α (CEBPα)等來影響脂肪細胞的分化。通過RNAi功能缺失(loss-of-function)實驗,確認了其中10種 LncRNA與脂肪細胞的分化高度相關(guān)，并將其命名為lnc-RAP-1～lnc-RAP-10，其中l(wèi)nc-RAP-1 通過與異構(gòu)核核糖核酸蛋白U (hnRNPU)相互作用調(diào)節(jié)脂肪生成。近期研究發(fā)現(xiàn):Blnc1 (brown fat LncRNA 1)通過生成Blnc1/hnRNPU/EBF2核糖核酸蛋白復(fù)合物來促進褐色和米黃色脂肪細胞的分化，增強UCP1等產(chǎn)熱基因的表達。此外，Blnc1本身也受EBF2調(diào)控[23-24]。Wei 等[25]的研究表明:PU.1 AS LncRNA可通過與PU.1 mRNA形成順義-反義復(fù)合物來促進脂肪生成。上述研究結(jié)果表明:LncRNA對祖細胞的分化和脂肪生成起著重要調(diào)控作用。

表2為與MSCs成脂分化相關(guān)的LncRNA。

表2 與MSCs成脂分化相關(guān)的LncRNA

3 LncRNA與骨肉瘤的關(guān)系

骨肉瘤是一種間質(zhì)來源的腫瘤。目前認為骨肉瘤是一種干細胞分化受阻的疾病。在干細胞分化的過程中，骨肉瘤細胞分化阻滯階段越早，腫瘤惡性程度就越高，增殖就越快，也更容易轉(zhuǎn)移。越來越多的研究表明：LncRNA與骨肉瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。一些LncRNA 如H91、HOTAIR、TUG1、DANCR、BCAR4、FGFR3-AS1、HOTTIP、HULC、MALAT-1、UCA1等在骨肉瘤中上調(diào)，被認為是癌基因; TUSC7和MEG3 則在骨肉瘤中下調(diào)，被認為是抑癌基因。此外,LINC00161、HOTTIP、ODRUL的表達與骨肉瘤耐藥相關(guān)。這些 LncRNA 調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥的機制包括ceRNA、 Wnt/β-catenin pathway等[26]。

LncRNA H19不但在成骨分化中起著重要調(diào)控作用，也與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Ulaner等[27]的研究發(fā)現(xiàn)：H19和IGF2印記丟失經(jīng)常出現(xiàn)在腫瘤中。印記丟失與H19上游CTCF結(jié)合位點的差異甲基化有關(guān)。IGF2印記表達可引起CTCF結(jié)合位點去甲基化，導(dǎo)致H19印記丟失[28]，促進骨肉瘤形成。敲除H19的小鼠出現(xiàn)過度生長的表型，可能也與H19對IGF2表達的調(diào)控有關(guān)[29]。由此可見,H19可作為抑癌因子。但是，H19也可能促進骨肉瘤形成。Li 等[30]的研究發(fā)現(xiàn)：H19可作為 ceRNA，通過競爭性結(jié)合miR-200s來促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移。Chan等[31]在成熟的成骨細胞中研究了Hedgehog信號在骨肉瘤發(fā)展中的作用。結(jié)果表明：Hedgehog信號異?？梢餣ap1和 H19過表達，從而促進骨肉瘤形成。He等[32]的研究表明：腫瘤抑制因子miR-141過表達可抑制成骨細胞增殖，在骨肉瘤中miR-141則通過下調(diào)H19或miR-675誘導(dǎo)細胞凋亡。由此可見，H19在骨肉瘤的不同時期發(fā)揮著不同的作用，可以作為抑癌因子，也可能促進骨肉瘤形成。

Jiang等的研究表明：LncRNA DANCR對骨肉瘤有促瘤作用，過表達的DANCR在體外可增加骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)可促進異種移植瘤生長和肺轉(zhuǎn)移。pull-down分析和熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎篋ANCR可通過競爭性結(jié)合miR-33a-5p，上調(diào)酪氨酸激酶受體AXL的表達。此外，DANCR可增強AXL-Akt通路下游的蛋白質(zhì)表達。DANCR在骨肉瘤組織中表達顯著增加，且與腫瘤大小和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，是骨肉瘤不良預(yù)后的獨立預(yù)測因子[33]。Min等[34]敲除DANCR后，U2OS細胞增殖速率顯著減慢，且細胞周期被阻滯在G0/G1期，同時p21表達水平上調(diào)而CDK2表達水平下調(diào)，證明DANCR可能是一種致癌基因，它促進了骨肉瘤的增殖。

LncRNA TUG1也是一個在骨肉瘤中高表達的LncRNA。Zhang等[35]證明了敲除TUG1表達可以抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。其他研究則進一步證明：TUG1作為miR-335-5p[36]、miR-153[37]及miR-9-5p[38]的ceRNA提高了骨肉瘤細胞遷移能力和侵襲性。

LncRNA HOTAIR 在骨肉瘤細胞中高表達[39]。Li等[40]的實驗結(jié)果表明： HOTAIR 通過 HOTAIR-miR126-DNMT1-CDKN2A軸來調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的活力和凋亡。 具體來說，HOTAIR通過抑制miR-126的表達來激活DNMT1。此外，HOTAIR通過DNA超甲基化失活CDKN2A啟動子，從而抑制CDKN2A的表達。由此可見：HOTAIR 是一種致癌基因，能促進骨肉瘤細胞的增殖，抑制其凋亡[41]。

LncRNA tumor suppressor candidate 7 (TUSC7，又名LOC285194) 在骨肉瘤細胞中表達顯著下調(diào)，過表達時可抑制骨肉瘤細胞增殖[42]。敲除成骨細胞中的TUSC7表達可抑制細胞凋亡，調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因，從而促進成骨細胞增殖。 TUSC7是一種由p53控制的腫瘤抑制因子，通過抑制mir-211而抑制細胞增殖[43]。而miR-211是一種內(nèi)源性的Runx2 抑制劑，可抑制MSCs 成骨分化，促進MSCs向脂肪細胞分化[44]。

與骨肉瘤相關(guān)的LncRNA見表3。

表3 與骨肉瘤相關(guān)的LncRNA

4 結(jié)束語

本文綜述了LncRNA在MSCs細胞干性維持及成骨、成脂分化過程中的調(diào)控作用及相關(guān)機制以及對骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程的影響。目前，LncRNA的研究還處于起步階段，關(guān)于LncRNA參與MSCs細胞多向分化調(diào)控的研究還比較少，其機制也尚未闡明。但是從有限的報道中可以看出：LncRNA在MCSs增殖與分化平衡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了非常重要的作用，不但在MCSs干性維持和多向分化方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而且與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。以DACER為例，DANCR可使MCSs細胞停留在未分化狀態(tài)，當其下調(diào)時可促進MSCs成骨分化，在骨肉瘤組織中DANCR表達顯著增加，且過表達的DANCR在體外可增加骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。這也從另一個角度證明增殖與分化的平衡可使MSCs發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪或其他類型的細胞，當這一平衡被打破時，則可能產(chǎn)生骨肉瘤等疾病。

LncRNA 在腫瘤診斷、臨床分期和預(yù)后判斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，也可能作為潛在的治療靶點為新靶向藥物開發(fā)提供依據(jù)。進一步明確LncRNA 調(diào)控MSCs增殖與分化的復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)，對于骨組織工程發(fā)展具有重要意義，也可為腫瘤治療提供新的突破口。