王丹妮 汪雪雁 伍志靈 陳春 秦勝芳 歐敏

在我國，肺癌占所有惡性腫瘤死亡的20%以上[1]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的主要調(diào)控方式之一，已有大量研究證實(shí)了DNA甲基化與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的密切關(guān)聯(lián)[2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白147（TMEM147）和TMEM207分別與直腸癌細(xì)胞增殖、胃癌細(xì)胞遷移浸潤有關(guān)，作為與上述基因同族類似的跨膜蛋白，TMEM196亦具有細(xì)胞分化、移行、同型粘附調(diào)控作用，文獻(xiàn)報(bào)道其在肺癌的增殖、侵襲等過程中扮演了重要角色[3-4]。此次研究選取60例肺癌組織標(biāo)本及30例正常肺組織標(biāo)本，觀察TMEM196基因甲基化及其在肺癌發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：單細(xì)胞凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（英國Perceptive公司）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基因擴(kuò)增儀（德國Eppendorf公司）。

主要試劑：石蠟包埋組織基因組快速提取試劑盒（DP330，北京天根生化科技有限公司）；Wizard基因組DNA純化試劑盒（美國Promega公司）；5-氮-2’-脫氧胞苷（5-Aza-Cd，美國Sigma公司）；Trizol總RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）。

1.2 標(biāo)本來源

在獲取醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并征得受試者知情同意后，選取60例肺癌組織標(biāo)本及30例正常肺組織標(biāo)本，肺癌標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查明確病理分型，標(biāo)本取樣前受試者均無放化療治療史。于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）采購10株肺癌細(xì)胞株，分別為H1975、H446、H1395、95D、LTEP、A549、SPC-A-1、H358、H460 及 H1650，于10% FBS PRMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，二氧化碳濃度5%。

1.3 DNA提取及甲基化分析

參照DP330試劑盒使用說明書自石蠟組織標(biāo)本中提取DNA，以亞硫酸氫鈉行基因組DNA修飾處理，對修飾后的DNA行純化、回收，參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（MSP）非甲基化引物（U）及甲基化引物（M）[5]，詳見表1。將修飾后的DNA行PCR擴(kuò)增，以亞硫酸氫鹽測序聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（BSP）分析擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳、切膠和純化結(jié)果，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：應(yīng)用M引物后可見擴(kuò)增產(chǎn)物說明存在DNA甲基化，應(yīng)用U引物后可見擴(kuò)增產(chǎn)物說明不存在DNA甲基化，應(yīng)用M引物、U引物后均可見擴(kuò)增產(chǎn)物說明存在部分DNA甲基化。

表1 甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)非甲基化引物及甲基化引物序列設(shè)計(jì)

1.4 去甲基化

將TMEM196基因甲基化的肺癌細(xì)胞株置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中孵育，培養(yǎng)溫度37℃，二氧化碳濃度5%。以適宜密度接種對數(shù)期生長細(xì)胞，24 h后添加5-Aza-Cd行去甲基化處理，終濃度分別為2 μM、5 μM及10 μM，待24 h后丟棄培養(yǎng)液，重新加入對應(yīng)濃度的5-Aza-Cd培養(yǎng)液，重復(fù)2次。對照組細(xì)胞以不含5-Aza-Cd的同體積培養(yǎng)液處理。于第4 d采集上述培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行mRNA提取及mRNA表達(dá)分析。

1.5 mRNA提取及mRNA表達(dá)分析

采用Trizol法提取肺癌組織細(xì)胞株RNA，行定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析，包括引物合成、逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成、PCR反應(yīng)三個(gè)步驟[7]，引物合成序列設(shè)計(jì)詳見表2。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，凝膠成像分析系統(tǒng)成像并保存結(jié)果。

表2 TMEM196基因及β-actin引物序列設(shè)計(jì)

1.6 分析指標(biāo)

觀察肺癌組織、正常組織TMEM196基因甲基化率，比較不同臨床病理特征肺癌患者肺癌組織TMEM196基因甲基化率，并分析肺癌細(xì)胞株TMEM196基因甲基化率及5-Aza-Cd去甲基化處理后TMEM196基因表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)軟件使用SAS9.2。

2 結(jié)果

TMEM196經(jīng)PCR測序及MSP檢測，肺癌組織TMEM196基因甲基化率為58.33%（35/60），正常組織均未見TMEM196基因甲基化，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

TMEM196不同分化程度、臨床分期肺癌患者肺癌組織TMEM196基因甲基化率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征肺癌患者TMEM196基因甲基化率比較（n/%）

TMEM196以正常上皮組織細(xì)胞為參照，根據(jù)β-actin計(jì)算肺癌TMEM196基因相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，去甲基化處理前，除H358細(xì)胞株外，其余9株肺癌細(xì)胞株TMEM196基因表達(dá)均缺失；去甲基化處理后，全部肺癌細(xì)胞株TMEM196基因表達(dá)均明顯升高。見表4。

表4 肺癌細(xì)胞株MEM196基因表達(dá)量變化分析（相對表達(dá)量）

3 討論

導(dǎo)致肺癌患者生存質(zhì)量較差的重要原因?yàn)樵缙诖_診率偏低，肺癌復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制以及可靠早期診斷方法的欠缺，是影響患者生存時(shí)間的主要原因，因此，近年來臨床愈發(fā)注重肺癌發(fā)病機(jī)制的探索以及早期診斷方法、靶向治療思路的研究[8-9]。

既往關(guān)于腫瘤表觀遺傳學(xué)的研究結(jié)論指出，雜合性缺失、基因突變以及DNA甲基化均為腫瘤發(fā)生的常見因素[10]，其中，DNA甲基化是最為重要的表觀遺傳修飾方式，該過程主要由甲基轉(zhuǎn)移酶催化主導(dǎo)，甲基基團(tuán)以共價(jià)結(jié)合方式移動(dòng)至鳥嘌呤（CpG）、胞嘧啶及二核苷酸胞嘧啶，可導(dǎo)致原癌基因激活、染色體穩(wěn)定性下降、轉(zhuǎn)座子表達(dá)異常，并誘發(fā)抑癌基因大量失活[11-12]。大量研究顯示，結(jié)腸癌癌前病變時(shí)已可檢出HPP1基因甲基化，而VEZT啟動(dòng)子區(qū)甲基化可導(dǎo)致VEZT基因表達(dá)量大幅下降[13-15]。TMEM196基因定位于染色體7P21.1，與HPP1、VEZT基因跨膜結(jié)構(gòu)類似，且已有體外研究發(fā)現(xiàn)TMEM196基因在肺癌組織中啟動(dòng)子區(qū)域CpG島可見明顯甲基化[16]，說明這一基因可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。本研究正常組織中TMEM196基因均未見甲基化，而肺癌組織TMEM196基因甲基化率高達(dá)58.33%，說明TMEM196基因甲基化在肺癌發(fā)生過程中具有普遍性。與此同時(shí)，隨著患者分化程度的下降以及臨床分期的上升，其肺癌組織TMEM196基因甲基化率呈上升趨勢，提示TMEM196基因甲基化可能參與了肺癌的分化、增殖、侵襲等多個(gè)過程，與肺癌的進(jìn)展亦具有密切關(guān)聯(lián)。

基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化主要對基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)產(chǎn)生抑制作用[17]，而上述研究結(jié)果僅可顯示TMEM196基因在肺癌組織中表達(dá)情況，無法證實(shí)TMEM196基因甲基化對其表達(dá)調(diào)控的影響。通過后續(xù)去甲基化試驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)去甲基化處理后TMEM196基因表達(dá)明顯上調(diào)，說明TMEM196基因甲基化是影響該基因表達(dá)的主要原因?？梢哉J(rèn)為，在肺癌發(fā)生的過程中，TMEM196基因甲基化是導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)甚至失活的主要原因[18]，且隨著病情進(jìn)展，TMEM196基因表達(dá)呈進(jìn)一步下降趨勢。因此，TMEM196可能是針對肺癌的候選抑癌基因，進(jìn)一步探索TMEM196參與肺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，有望為肺癌的早期診斷、療效評估及靶向治療提供更為全面的思路。