史清釗　陳怡月　王智強　李丁丁　于海燕　姚政立　王蘊紅

摘 要： 探討運動誘發(fā)心肌適應(yīng)過程中是否有心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的參與。方法：大鼠進行跑臺耐力訓(xùn)練，建立不同訓(xùn)練強度、不同訓(xùn)練時間和周期的大鼠運動模型，在末次訓(xùn)練結(jié)束后24 h取材，取左室心肌，采用western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、GRP94、ERP72和CHOP的表達。結(jié)果：1）5周運動模型組：時間遞增組大鼠心肌GRP78較安靜組顯著升高，GRP94、ERP72、CHOP蛋白表達無顯著性差異；恒時恒速組、速度遞增組大鼠心肌GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白表達較安靜組未見顯著性差異。2）10周運動模型：恒時恒速組、速度遞增組大鼠心肌GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白表達較安靜組無顯著差異。結(jié)論：以延長運動持續(xù)時間為特征的5周耐力訓(xùn)練誘發(fā)GRP78蛋白表達升高，而速度恒定或速度遞增的耐力訓(xùn)練沒有誘發(fā)心肌與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的蛋白表達，提示運動方式可能與心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

關(guān)鍵詞：運動；心??；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

中圖分類號：G 804.2 學(xué)科代碼：040302 文獻標(biāo)識碼：A

Abstract：Objective： To explore whether endoplasmic reticulum stress is involved in the process of exercise-induced myocardial adaptation. Methods： Rats were subjected to treadmill exercise training with different exercise intensity， duration and exercise program， and then euthanized 24h after last run. GRP78， GRP94 and ERP72 expressions in myocardium of left ventricular were measured with western blot analysis. Results： 1） there was a significant increase in the GRP78 expression but no significant difference in the expression of GRP94， ERP72， CHOP in duration-increase group. No significant changes in the expression of GRP78， GRP94， ERP72 and CHOP protein expressions in rats undergoing constant speed and speed-increase training were observed in all rats of 5-week trained groups； 2） No significant changes in the expression of GRP78， GRP94， ERP72 and CHOP were observed in all rats of 10-week trained groups when compared with age-matched control group. Conclusion： GRP78 expression was induced in rat myocardium after five-week duration-increase endurance training， while no significant change in GRP78 expression was observed after constant speed or speed-increase training. It suggests that exercise mode might be associated with exercise-induced endoplasmic reticulum stress.

Keywords： exercise； cardiac muscle； endoplasmic reticulum （ER）；glucose-regulated protein 78

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERS）可由缺氧、供能狀態(tài)變化及生長刺激因子等生理因素啟動，適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，能夠提高對應(yīng)激刺激的耐受力，有利于細(xì)胞內(nèi)鈣和蛋白質(zhì)加工等穩(wěn)態(tài)的恢復(fù) [1-4]。研究表明，阻抗運動能夠誘發(fā)骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的激活，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與運動適應(yīng)有密切關(guān)系[5]；但有關(guān)運動誘發(fā)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究還鮮見報道。已有研究證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了壓力超負(fù)荷、機械應(yīng)力等引起心肌損傷和心肌肥大的發(fā)生發(fā)展[6]，并且我們前期的研究也顯示，長時間的耐力運動導(dǎo)致與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的eIF2/ATF4信號通路激活[7]，提示運動可能引起心肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。但也有研究報道了不同的結(jié)果[8]。由于成熟的心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)鈣和蛋白質(zhì)質(zhì)量的改變直接影響到心肌結(jié)構(gòu)和功能，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅對應(yīng)激刺激非常敏感[9]，而且在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用；因此，研究運動訓(xùn)練是否誘發(fā)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，將有助于我們認(rèn)識運動心肌適應(yīng)及心肌損傷的發(fā)生機制。為此，我們通過測定不同訓(xùn)練負(fù)荷、強度、時間和運動周期的耐力訓(xùn)練模型的心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)，來探討運動訓(xùn)練的諸因素在誘發(fā)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中可能發(fā)揮的作用，以揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制是否參與運動訓(xùn)練導(dǎo)致心肌適應(yīng)的過程及其可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周雄性SPF級Sprague Dawley大鼠52只，體質(zhì)量（230±14）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)中心提供（動物合格證號SCXK（京）2015-0004）。標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料分籠飼養(yǎng)，自由進食和飲水，動物飼養(yǎng)環(huán)境為動物房溫度23 ～25 ℃，相對濕度在45%～55%。每天光照和黑暗交替各12 h。

1.2 運動模型建立

大鼠經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機分為5周訓(xùn)練模型（安靜對照組6只、速度遞增組8只、恒時恒速組8只、時間遞增組8只）和10周訓(xùn)練模型（安靜對照組6只、恒時恒速組8只、速度遞增組8只）。采用跑臺訓(xùn)練建立模型，每周訓(xùn)練5 d。由于我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，采用該運動方案訓(xùn)練能夠引起心肌蛋白質(zhì)合成相關(guān)信號分子激活水平的變化[10-11]，因此，采用上述模型，便于觀察不同訓(xùn)練方式、負(fù)荷和訓(xùn)練周期對心肌的作用效果[3]。5周運動模型的建立參照本實驗室已有模型，即：運動組大鼠先完成為期3周的速度遞增的訓(xùn)練，使每天訓(xùn)練時間達到1 h，運動速度從12 m/min逐漸增到24 m/min，再分成3組——速度時間不變組（C），速度遞增組（S）和時間遞增組（D）進行為期2周的訓(xùn)練，見表1。 10周的運動訓(xùn)練模型則分為速度遞增組和恒速組進行訓(xùn)練。速度遞增組的運動速度每周增加約3 m/min， 在運動訓(xùn)練到10周時達到34～36 m/min，而恒速組則在第2周達到24 m/min，以此速度運動直到10周，見表2。運動組大鼠在末次訓(xùn)練后24 h與對照組大鼠同時取材，低溫生理鹽水沖洗心臟，濾紙吸干后稱全心和左心重，將左室心肌-80 ℃保存。

1.3 Western blot檢測

稱取適量心肌組織，按重量：體積比為1∶9加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，靜置20 min，4 ℃，13 000 r/min離心20 min。取上清 BCA法蛋白定量。以裂解液調(diào)整蛋白濃度，加入5X上樣緩沖液，使樣品終濃度為4 ？滋g/？滋L。95 ℃，煮沸10 min后，制成電泳上樣液。配置12%的SDS-PAG分離膠和5%濃縮膠，加樣電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜。將膜在一抗中孵育，4 ℃過夜。一抗溶于封閉液，GRP78（Abcam，ab21685）1∶4 000稀釋，GRP94（CST， 2104）1：4 000；ERP72（CST，5033）1∶4 000，CHOP（GeneTex，GTX112827）1∶2 000；GAPDH（TDY042）1∶20 000；β-tubulin（TDY043）1∶5 000。洗膜后在二抗（中杉金橋公司提供，1∶5 000用封閉液稀釋）中室溫孵育2 h；洗膜后采用ECL發(fā)光試劑與膜在暗室中反應(yīng)曝光、顯影、定影。膠片掃描后，運用Image J軟件處理后，使用TotaLab Quant軟件系統(tǒng)進行圖像分析，計算目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶灰度值，并用目的蛋白的灰度值與相應(yīng)的內(nèi)參蛋白灰度值對比，得出每個樣品目的蛋白的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差或標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進行單因素方差分析。先進行方差齊性的顯著性檢驗，若方差齊時，用LSD法檢驗；若方差不齊時，用Tamhanes法檢驗，顯著性水平取P<0.05 。

2 結(jié)果

2.1 大鼠左心質(zhì)量和左心系數(shù)

由表3可知，經(jīng)過5周的運動訓(xùn)練，速度遞增組與時間遞增組的大鼠體質(zhì)量增長與安靜組比較，差異顯著（P<0.05），并且速度遞增組和時間遞增組大鼠的左心系數(shù)與安靜對照組相比，差異顯著（P<0.05）；而恒時恒速組的體質(zhì)量、左心系數(shù)與安靜對照組相比，均無顯著性變化（P>0.05）。速度遞增組、恒時恒速組、時間遞增組的左心系數(shù)比較，未見顯著差異（P<0.05）。

由表4可知，經(jīng)過10周的運動訓(xùn)練，速度遞增組、恒時恒速組的左心質(zhì)量與安靜對照組比較，均無顯著變化（P>0.05）。與安靜組相比，速度遞增組、恒時恒速組的左心系數(shù)均呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。

2.2 5周模型大鼠心肌GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白的表達

經(jīng)過5周的運動訓(xùn)練，大鼠心肌中GRP78蛋白表達在時間遞增組的表達量顯著高于安靜組（P<0.05）；而恒時恒速組和速度遞增組的GRP78蛋白表達水平與安靜組大鼠比較，未見顯著變化（P>0.05）。時間遞增組、恒時恒速組和速度遞增組的GRP94、ERP72、CHOP蛋白表達與安靜組大鼠比較，未見顯著變化（P>0.05），如圖1所示。

2.3 10周訓(xùn)練大鼠心肌GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白表達

經(jīng)過10周的運動訓(xùn)練，恒時恒速組、速度遞增組大鼠心肌中的GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白表達量與安靜組比較，未見顯著差異（P>0.05），恒時恒速組與速度遞增組彼此之間比較，未見顯著差異（P>0.05），如圖2所示。

3 討論

已有研究顯示，心肌在機械牽拉、容量或壓力超負(fù)荷時，可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）[12]，UPR首先通過激活PERK/eIF2α信號通路引起新的蛋白質(zhì)翻譯啟動，并通過誘導(dǎo)參與蛋白質(zhì)合成、折疊和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白表達上調(diào)，以終止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，恢復(fù)ER的功能。這些蛋白包括GRP78、GRP94、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（ERP）72等[6]，因此，這些蛋白表達的升高是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個重要標(biāo)志[13]。

本實驗結(jié)果顯示，以延長運動時間為特征的遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練可誘發(fā)GRP78表達升高。我們以往的研究也表明，以延長運動時間為特征的耐力訓(xùn)練可誘發(fā)eIF2α/ATF4激活水平提高[3]，而PERK/eIF2α/ATF4信號通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整合應(yīng)激反應(yīng)的重要的信號通路[13]，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白聚集，并與GRP78結(jié)合，能夠活化PERK，進而磷酸化eIF2α由于該信號通路的激活水平提高，蛋白質(zhì)合成減少[14-15]。我們在同一模型上的研究也觀察到耐力訓(xùn)練大鼠心肌mTOR/P70S6K激活水平的下降，提示運動心肌蛋白質(zhì)合成的降低，可能與誘發(fā)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。研究表明，當(dāng)GRP78表達升高時，其與錯誤折疊或未折疊蛋白結(jié)合，以降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的積累，起到恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，保護細(xì)胞存活的作用[4]。GRP78是HSP家族的成員，它在安靜狀態(tài)即有表達，并且當(dāng)饑餓、衣霉素、鈣離子載體A23187或高溫（40 ℃）等干預(yù)因素作用時表達提高[16]，但運動訓(xùn)練的心肌是由哪些因素誘發(fā)其表達，還未見報道。此外，有研究顯示，GRP78參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)，并且受到其他信號分子如IGF-1以及胰島素等介導(dǎo)的信號通路的調(diào)節(jié)[17-18]。而這些信號在運動訓(xùn)練中的活性變化對GRP78表達的作用也有待進一步研究。

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，除了引起GRP78蛋白表達升高外，還能夠誘導(dǎo)包括伴侶蛋白GRP94、ERP72等其他參與蛋白質(zhì)合成、折疊和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控的蛋白表達升高，并且當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)劇烈時，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡分子CHOP蛋白也會表達提高[15]。但在本實驗中，即使是延長運動時間的耐力訓(xùn)練組大鼠，也未觀察到心肌GRP94、ERP72、CHOP蛋白表達的上調(diào)，提示運動誘發(fā)的心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)并未發(fā)生細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的劇烈變化。同時本實驗還觀察到，5周遞增速度和恒速組的大鼠繼續(xù)訓(xùn)練到10周，無論是恒速還是遞增速度訓(xùn)練，心肌GRP78表達及GRP94、ERP72、CHOP蛋白的表達與安靜對照組相比均未出現(xiàn)明顯變化，ERP72也只在10周遞增負(fù)荷運動心肌表達升高，提示耐力訓(xùn)練所誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達只與運動方式、運動負(fù)荷有關(guān)。有研究證明，短期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)，能夠清除錯誤折疊蛋白，對細(xì)胞的存活起到保護作用，是細(xì)胞的適應(yīng)反應(yīng)，而長時間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，則導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，甚至細(xì)胞死亡[12，19]。因此，上述結(jié)果也表明，運動應(yīng)激與缺血缺氧等病理因素所導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)存在本質(zhì)上的差異。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，GRP蛋白能夠主動移位到細(xì)胞其他的部位，如細(xì)胞表面，參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴增、凋亡和免疫的調(diào)節(jié)[20]，這也提示它們在運動心肌適應(yīng)中可能存在較為廣泛的作用，運動訓(xùn)練是通過何種機制引起心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激蛋白表達，有待于進一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，以延長運動時間為特征的耐力訓(xùn)練可能誘發(fā)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。這種運動誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與運動的方式和訓(xùn)練量相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達可能對細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)起到保護作用。

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