高彬 周慧 張樹芹 朱樹華

摘要：為探究亞硝酰氫（nitroxyl，HNO）對草莓果實冷藏保鮮效果的影響，以“甜查理”草莓作為試驗材料，用不同濃度HNO供體1-亞硝基環(huán)己酸酯（1-nitroso cyclohexanoate，NCA）溶液浸泡處理草莓果實，在0℃條件下恒溫貯藏，研究不同濃度HNO供體處理對“甜查理”草莓采后冷藏期間果實硬度、可溶性固形物、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脯氨酸含量及抗氧化酶活性等的變化。結(jié)果表明，HNO供體處理有效地保持了采后草莓果實的硬度，減緩了果實中可溶性固形物含量的升高，抑制了ROS和MDA含量的升高，減緩了脯氨酸含量降低，使草莓果實在采后冷藏過程中能較長時間保持果實風味。HNO供體處理延緩草莓超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，抑制過氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性，從而增強對超氧自由基的清除能力，減輕超氧自由基引起的傷害，延緩果實褐變腐敗。綜合來看，當HNO濃度為0.2 g/L時，草莓的冷藏保鮮效果最佳。

關(guān)鍵詞：草莓；亞硝酰氫；冷藏；貯藏品質(zhì)

中圖分類號：S668.4：TS255.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）05-0129-07

Abstract To investigate the effect of nitroxyl （HNO） on preservation of strawberry fruits during cold storage， the strawberry fruits of Sweet Chalie cultivar were treated with different concentrations of HNO donor solution and stored at 0℃. The physiological indicators including fruit firmness， soluble solid content， reactive oxygen （ROS） activity， malonaldehyde （MDA） content， proline content and antioxidant enzyme activities were investigated in this paper. The results showed that HNO donor treatment effectively maintained the fruit firmness of postharvest strawberry fruits， delayed the decrease of soluble solid content， inhibited the contents of reactive oxygen species and malondialdehyde， and delayed the content decrease of proline， so the strawberry fruits could be preserved for longer time with better flavour under cold storage. The HNO treatment decreased the increase of SOD activity and inhibited the activities of POD and PPO of strawberry during storage， so as the ability of scavenging superoxide radicals was enhanced and the damage caused by superoxide radicals was reduced， which delayed the fruit browning and rot. In conclusion， treating strawberry fruits with 0.2 g/L HNO could obtain the optimum preservation effect under cold storage.

Keywords Strawberry fruits； HNO； Cold storage； Quality

草莓（Fragaria ananassa Duch）屬薔薇科草莓屬多年生常綠草本植物，由于其色艷形美、柔軟多汁、酸甜可口，有較高的營養(yǎng)價值，被譽為“水果皇后”，受到廣大消費者青睞。但是，草莓含水量高，組織嬌嫩，極易受機械損傷和真菌感染，腐敗變質(zhì)，限制了草莓的銷售與加工。因此，研究適宜的草莓貯藏保鮮技術(shù)，使其保持較好的品質(zhì)，降低草莓采后損失是草莓生產(chǎn)銷售中的當務(wù)之急。

在草莓保鮮方面，國內(nèi)外開展了大量研究。不同的保鮮劑對草莓具有不同的保鮮效果。余璐璐等[1]發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L水楊酸處理草莓后，草莓采后儲藏保鮮時間明顯延長，處理后的草莓可在常溫下保鮮6 d以上。安磊等[2]比較了殼聚糖、海藻酸鈉、魔芋葡甘聚糖的保鮮作用及特點，表明3種多糖對草莓貯藏期內(nèi)的多個生理生化指標具有明顯的改善作用，能有效延長草莓貨架期；其中殼聚糖保鮮作用最好，魔芋葡甘聚糖對草莓有機酸的維持作用最好。

亞硝酰氫（nitroxyl，HNO）可以參與許多化學(xué)和生物反應(yīng)過程。例如，細菌反硝化過程可生成HNO[3]；HNO作為氧化劑可以氧化還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）[4， 5]；HNO作為還原劑可以將超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的Cu2+還原成Cu+：NO-+ SODCuⅡ→ NO + SODCuⅠ[6]；HNO還可以與氧化的血紅蛋白（如高鐵血紅蛋白）反應(yīng)生成亞硝酰亞鐵：HNO+HbFeⅢ→HbFeⅡ-NO+H+[7]。Miranda等[8，9]使用反應(yīng)動力學(xué)來確定HNO與各種化學(xué)/生物反應(yīng)物反應(yīng)的相對反應(yīng)速率，并推導(dǎo)出近似的速率常數(shù)；HNO的相對反應(yīng)速率為：氧合肌紅蛋白>谷胱甘肽（glutathione，GSH）、辣根過氧化物酶>N-乙酰半胱氨酸、CuZnSOD、MnSOD、高鐵肌紅蛋白、過氧化氫酶>氮氧自由基、鐵螯合物C>O2。由于細胞內(nèi)存在較高濃度的GSH，上述結(jié)果表明細胞中大部分HNO可能與GSH反應(yīng)消耗有關(guān)[10]。HNO也可以與泛醇[11]、細胞色素C[12]、錳超氧化物歧化酶[13]和黃嘌呤氧化酶[14]反應(yīng)生成NO，同時HNO在醫(yī)藥領(lǐng)域與心血管病、動脈硬化、糖尿病等眾多疾病有著緊密的關(guān)系[15-17]，近年來引起了廣泛關(guān)注，但HNO作為保鮮劑的研究鮮有報道。

為此，本研究以“甜查理”草莓為研究材料，選用不同濃度的HNO供體1-亞硝基環(huán)己酸酯（1-nitroso cyclohexanoate，NCA）溶液，研究NCA釋放的不同濃度HNO處理后草莓冷藏期間的各種生理指標的變化，以期為HNO用于水果保鮮奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓品種為“甜查理”。從長勢良好的植株上隨機挑選大小均勻、無機械損傷、無病蟲害的帶柄七成熟果實，采摘后立刻運回實驗室，4℃下預(yù)冷24 h。

硫代巴比妥酸、核黃素、乙二胺四乙酸購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸、甲苯購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；氮藍四唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）購自蘇州亞科科技有限公司；聯(lián)苯胺購自阿拉丁試劑有限公司；磺基水楊酸購自上海山浦化工有限公司；NCA為實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

A11Bs25型粉碎機（德國IKA公司），BS124S型電子分析天平（德國賽多利斯），HH-2型恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），PHS-3D型pH計（上海精科雷磁有限公司），GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），UV-2450型紫外分光光度計（日本島津公司），WY015R型手持折光儀（遼寧賽亞斯科技有限公司），GY-4型果實硬度計（山海山度公司）。

1.3 試驗方法

試驗分為兩組，處理組以NCA為HNO供體，分別配制成濃度為0.1、0.2、0.3 g/L的溶液浸泡草莓，對照組（CK）以蒸餾水浸泡草莓。每組浸泡5 min，擦干表面溶液，將草莓置于0℃恒溫恒濕柜中，每天取樣一次，共取樣5 d。取樣時將果肉切塊后液氮冷凍處理，樣品置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。各指標測定時均重復(fù)3次。

1.3.1 果實硬度和可溶性固形物測定 用GY-4果實硬度計測定果實硬度，探頭直徑5 mm。測試結(jié)果取下壓峰值，每種處理取5個果實，每個草莓果實取2個測量點測試，共重復(fù)10次。

將草莓果實在研缽中研磨，吸取草莓汁，用手持式折光儀測定其可溶性固形物含量。

1.3.2 酶活性測定 取5 g草莓冷凍研磨，加入15 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）振蕩混勻，充分浸提10 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液為粗酶液。

SOD活性采用NBT光還原法測定[18]。取粗酶液30 μL，加入3 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液〔含13 mmol/L甲硫氨酸，63 μmol/L氮藍四唑（NBT），1.3 μmol/L核黃素和10 mmol/L EDTA〕，在4 000 lx（光照強度）下反應(yīng)30 min，出現(xiàn)顏色變化，測定560 nm處吸光度。以未加酶液的反應(yīng)體系為空白對照，以單位時間內(nèi)抑制NBT光還原率50%的酶量為一個酶活單位。

POD活性采用聯(lián)苯胺法測定[19]。將5 mmol/L聯(lián)苯胺-醋酸鈉溶液2 mL與粗酶液1 mL混勻，向混合液中加入1 mL 0.3% H2O2溶液并立即于580 nm波長下檢測其吸光度的變化，檢測時長為120 s。POD的單位酶活性定義為由POD的催化作用引起的580 nm下每秒內(nèi)增加0.001個單位的吸光度為一個酶活單位。

PPO活性采用鄰苯二酚法測定[20]。取pH 5.8磷酸鹽緩沖液1 mL，加入濃度為0.05 mol/L鄰苯二酚1 mL，混勻，30℃下水浴5 min，加入2 mL粗酶液迅速搖勻，對照以緩沖液代替粗酶液，在410 nm波長下測定吸光度的變化。在測定條件下每分鐘酶液吸光度值改變0.1為一個酶活單位。

1.3.3 丙二醛含量的測定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[21]。取1 g草莓果實，冷凍研磨，加入10 mL 10%三氯乙酸研磨至勻漿。充分提取后，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液2 mL，加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混勻后沸水浴15 min，冷卻后再次離心，取上清液在450、532、600 nm波長下測定吸光度，根據(jù)公式計算MDA濃度=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450，并根據(jù)提取液的體積計算樣品中丙二醛含量。

1.3.4 活性氧（ROS）含量的測定 參照Kim等[22]的方法，取0.5 g草莓果實，研磨至粉末，加入3 mL Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L，pH 7.2），于4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清10 μL，加入3 mL Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L，pH 7.2），再加入2 mmol/L 2′，7′-二氯熒光素乙二酸鹽（DCF-DA）溶液1 μL，混合均勻，在黑暗中室溫孵育0.5 h，用熒光分光光度計檢測其熒光強度。最大激發(fā)波長為485 nm，最大發(fā)射波長為530 nm，狹縫為5 nm。以Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L，pH 7.2）作為對照。

1.3.5 脯氨酸含量的測定 參照Bates等[23]的方法，取1 g草莓果實，研磨至粉末，加入10 mL 3%磺基水楊酸溶液，振蕩混勻。沸水浴浸提10 min，冷卻至室溫后，于4℃、4 000 r/min離心15 min，吸取2 mL上清液，加入2 mL冰醋酸和3 mL 25%酸性茚三酮顯色液，沸水浴加熱40 min后冷卻。加入5 mL甲苯充分振蕩，萃取紅色物質(zhì)，靜置40 min分層，移取甲苯層，紫外分光光度法測定520 nm處吸光度，計算脯氨酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2013處理數(shù)據(jù)并繪圖，DPS 7.5軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用LSD法在0.05顯著性水平進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度HNO供體處理對草莓果實硬度的影響

由圖1可見，冷藏條件下，各組草莓果實硬度隨時間延長表現(xiàn)為先上升后下降，處理組果實硬度高于對照組，且第1、2 d時差異顯著（P<0.05），0.2、0.3 g/L NCA處理組的果實硬度在前3 d保持較高水平，第1 d，兩者的果實硬度分別是對照組的1.34、1.31倍，第2 d分別為1.39、1.36倍。說明冷藏下HNO供體處理明顯地推遲采后果實軟化，較長時間保持了采后草莓的果實硬度，且0.2 g/L HNO供體處理在保持草莓果實硬度方面效果更為顯著。

2.2 不同濃度HNO供體處理對草莓果實可溶性固形物含量的影響

可溶性固形物含量的高低反映了貯藏過程中果實褐變的程度[24]。由圖2可知，冷藏條件下，可溶性固形物含量隨時間延長逐步上升。第1 d時，0.2、0.3 g/L NCA處理組的草莓可溶性固形物含量較高；之后，對照組和0.1 g/L NCA處理組上升較快，而0.2、0.3 g/L處理組上升明顯較慢。在3～5 d，0.2 g/L處理組的草莓可溶性固形物含量最低。即在冷藏后期，0.2 g/L HNO供體處理能更好地減緩草莓果實可溶性固形物含量的增加速度，較長時間地保持采后樣品果實的完整性，減緩了果實褐變。

2.3 不同濃度HNO供體處理對草莓果實酶活性的影響

由圖3可知，SOD活性隨冷藏時間延長先升高再下降。各組峰值均出現(xiàn)在第2 d，其中0.2 g/L NCA處理組為對照組的1.30倍。整體來說，0.2 g/L NCA處理的SOD活性高于其它處理，說明0.2 g/L HNO供體處理可以較長時間地保持采后草莓的果實品質(zhì)。

由圖4可知，POD活性隨冷藏時間延長先上升后下降。除第5 d外，各處理組POD活性均低于對照組且0.2 g/L NCA處理組的POD活性最小，前2 d時顯著低于對照組（P<0.05）。說明冷藏下HNO供體處理明顯降低了POD活性。

由圖5可知，隨冷藏時間延長，草莓中PPO活性除0.2 g/L NCA處理先上升后持續(xù)降低外，其余處理均先上升后下降再上升。除第4 d外，均是0.2 g/L處理組的PPO活性最小，且各處理組皆低于對照組。說明HNO供體處理能夠抑制PPO的活性，從而抑制草莓褐變。

2.4 不同濃度HNO供體處理對草莓果實活性氧含量的影響

由圖6可知，草莓采后冷藏期間活性氧含量持續(xù)升高。采后1 d內(nèi)，各組間ROS含量差異較小，之后，CK的ROS含量快速上升，明顯高于NCA處理組，而0.2 g/L NCA處理組ROS含量則低于其余處理。說明HNO對冷藏期間草莓果實活性氧含量的增加具有較好的抑制效果，以0.2 g/L NCA處理的效果最好。

2.5 不同濃度HNO供體處理對草莓果實丙二醛含量的影響

由圖7可知，草莓果實在冷藏期間MDA含量逐步升高。各處理組草莓MDA含量均低于對照組，且0.2 g/L處理組的草莓MDA含量最低。各組MDA含量在前3 d上升均較快，之后對照組繼續(xù)快速上升，而處理組則上升較慢。說明HNO處理能夠減緩采后草莓果實冷藏期間MDA含量的積累，降低草莓果實的膜脂過氧化程度。

2.6 不同濃度HNO供體處理草莓果實脯氨酸含量的變化

由圖8可知，各組在冷藏第1 d內(nèi)脯氨酸含量驟降，之后緩慢下降再略有上升。0.2、0.3 g/L NCA處理組的草莓脯氨酸含量均高于對照。對比可知，HNO供體處理對減緩了冷藏期間果實中脯氨酸含量的降低，有利于提高采后果實的耐貯性，其中尤以0.2 g/L NCA處理的效果最好。

3 討論與結(jié)論

草莓中富含維生素、多酚、糖類、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，香甜可口。但草莓在采摘后，隨貯藏時間和成熟度的增加，各項指標均有較大改變，無法維持較高的營養(yǎng)品質(zhì)。本試驗比較了不同濃度HNO供體處理對草莓采后冷藏保鮮的影響。結(jié)果表明，不同濃度HNO供體對采后草莓果實相關(guān)品質(zhì)都有一定的保持作用，0.2 g/L HNO供體處理比0.1、0.3 g/L HNO供體處理能更大程度地保持采后草莓的外觀、硬度、口感及營養(yǎng)品質(zhì)，可用于草莓采后保鮮。

蔡琦瑋等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)，果實硬度、含糖量是評價果實風味的常用指標，也是吸引消費者的重要因素。經(jīng)HNO供體處理的草莓樣品果實硬度與可溶性固形物含量能長時間保持較高的水平。脯氨酸是植物體內(nèi)普遍存在的一種保護物質(zhì)，在遭受低溫、干旱、高鹽脅迫時，體內(nèi)的游離脯氨酸會增加[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，HNO供體處理延緩了采后果實中脯氨酸含量的降低，使采后草莓在較長時間內(nèi)保持果實內(nèi)較高的脯氨酸含量。采后果實貯藏過程中活性氧的積累是導(dǎo)致果實衰老腐敗的重要原因之一。一旦植物體內(nèi)活性氧平衡被打破，過多的活性氧積累對生物大分子以及細胞膜產(chǎn)生破壞作用，從而加劇膜脂過氧化，導(dǎo)致膜脂過氧化終產(chǎn)物MDA的累積[27， 28]。本研究發(fā)現(xiàn)，HNO供體處理能夠明顯抑制采后草莓果實內(nèi)活性氧與MDA的積累，延緩果實衰老，從而延遲果實腐爛。HNO供體與低溫協(xié)同處理延遲脯氨酸含量降低的同時還抑制了MDA含量的升高，該結(jié)果在南瓜果實中已經(jīng)被證實[29]。

SOD是細胞內(nèi)清除活性氧系統(tǒng)的重要酶。SOD催化反應(yīng)2O·-2+2H+→H2O2+O2，把體內(nèi)具有潛在危害的O·-2除去，從而有效地阻止O·-2在植物體內(nèi)積累，使細胞內(nèi)自由基維持在低水平，防止細胞受自由基的毒害。本試驗中HNO處理提高冷藏期草莓SOD活性，增強對超氧自由基的清除能力，減輕超氧自由基引起的傷害，延緩果實衰老[30，31]。而POD和PPO活性與果實褐變密切相關(guān)[30]，HNO供體處理通過抑制POD和PPO的活性，導(dǎo)致褐變底物酚類物質(zhì)合成減少，降低了酚類物質(zhì)氧化速度，進而延緩了草莓的褐變進程。

因此，冷藏與HNO供體處理在果實采后貯藏期間能有效地保持果實營養(yǎng)品質(zhì)，延長果實貯藏時間，以冷藏+0.2 g/L HNO供體處理效果最好。

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