楊三東， 艾 利， 封 嬌， 唐 濤,， 王風(fēng)云， 郝青麗， 李 彤

(1. 南京理工大學(xué)，江蘇 南京 210094; 2. 大連依利特分析儀器有限公司，遼寧 大連 116023)

0 引 言

二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD或photo diode array ，PDA）是一種多通道光學(xué)吸收型檢測(cè)器，以二極管陣列模塊作為光探測(cè)器，可在幾十至幾百毫秒的時(shí)間內(nèi)同時(shí)采集多個(gè)波長(zhǎng)下的光強(qiáng)信息，可以用于對(duì)樣品進(jìn)行定性、定量以及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，常用于高效液相色譜系統(tǒng)中[1]。二極管陣列檢測(cè)器主要由多色儀和配套的電路系統(tǒng)組成，其中多色儀的光路示意圖如圖1所示。由于零部件設(shè)計(jì)加工存在誤差、光路調(diào)試過(guò)程存在不確定性，導(dǎo)致多色儀內(nèi)陣列探測(cè)器所接收到的光譜情況存在差異。為了保證光譜數(shù)據(jù)的可靠性，需要對(duì)多色儀的波長(zhǎng)進(jìn)行校準(zhǔn)。

圖1 多色儀光路系統(tǒng)示意圖

光源校準(zhǔn)法和吸收光譜校準(zhǔn)法是兩種常用的波長(zhǎng)校準(zhǔn)方法。由于低壓汞燈的光譜特征峰較多，且為線(xiàn)光源，多數(shù)儀器在組裝調(diào)試過(guò)程中都使用低壓汞燈作為波長(zhǎng)校準(zhǔn)光源[2]，波長(zhǎng)校準(zhǔn)結(jié)束后再將其更換為實(shí)際使用的光源—氘燈，有的儀器甚至將低壓汞燈置于儀器內(nèi)，便于儀器維護(hù)過(guò)程中使用。但是，通過(guò)Zemax軟件模擬和實(shí)際調(diào)試中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光源的中心偏離設(shè)計(jì)位置時(shí)，會(huì)使光路系統(tǒng)的分辨率降低、像差變大、光譜成像改變，從而使波長(zhǎng)值出現(xiàn)偏差。對(duì)于不同的光源來(lái)說(shuō)，光源中心位置出現(xiàn)偏差屬于正常現(xiàn)象，因此若采用低壓汞燈對(duì)多色儀進(jìn)行校準(zhǔn)，難免會(huì)降低波長(zhǎng)校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。吸收光譜校準(zhǔn)法通常以具有特征吸收波長(zhǎng)的固體或液體作為校準(zhǔn)物質(zhì)。液相色譜儀檢定規(guī)程JJG705—2014[3]規(guī)定用重鉻酸鉀溶液來(lái)檢定紫外檢測(cè)器，可將其用于波長(zhǎng)校準(zhǔn)。何海紅[4]使用咖啡因溶液對(duì)檢測(cè)器波長(zhǎng)進(jìn)行校準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)其特征峰峰形比較尖銳。含有稀土元素的物質(zhì)在紫外區(qū)具有特征吸收，適合用于波長(zhǎng)校準(zhǔn)過(guò)程[5-6]。ASTM E1657—98（2011）[7]中建議使用高氯酸鉺溶液、高氯酸鈥溶液、萘的甲醇溶液作為波長(zhǎng)校準(zhǔn)溶液。波長(zhǎng)校準(zhǔn)溶液的特征峰通常較寬，難以獲得準(zhǔn)確的峰值，從而影響波長(zhǎng)校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。專(zhuān)利US6423249[8]利用摻雜了硝酸鉺的溶膠凝膠玻璃作為波長(zhǎng)校準(zhǔn)物質(zhì)，該物質(zhì)在紫外可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍內(nèi)有多個(gè)尖銳的特征吸收峰，但該波長(zhǎng)校準(zhǔn)物質(zhì)的制備過(guò)程比較復(fù)雜，不利于推廣使用。

針對(duì)上述問(wèn)題，本文采用儀器原位光源——內(nèi)置氘燈，結(jié)合氧化鈥玻璃的雙校準(zhǔn)源對(duì)二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行波長(zhǎng)校準(zhǔn)，設(shè)計(jì)了不同的校準(zhǔn)方案，比較了它們的校準(zhǔn)結(jié)果，并利用重鉻酸鉀溶液對(duì)波長(zhǎng)校準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

自制光電二極管陣列檢測(cè)器多色儀的光路系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)與圖1相同，其中，光學(xué)聚焦系統(tǒng)利用透鏡將光聚焦在檢測(cè)池的中心，檢測(cè)池后再次通過(guò)配套的微透鏡將光聚焦在0.1 mm的狹縫中心。通過(guò)狹縫的光由平場(chǎng)凹面光柵進(jìn)行分光，所形成的光譜信息被陣列探測(cè)器接收檢測(cè)。多色儀所用平場(chǎng)凹面光柵的直徑50 mm，入臂和出臂分別為138.6 mm和132 mm。在陣列探測(cè)器上均勻排布512個(gè)光電二極管，并在位于光譜的380 nm附近放置長(zhǎng)20 mm的380 nm濾光片，用于消除光柵分光產(chǎn)生的二級(jí)光譜。自主開(kāi)發(fā)光譜專(zhuān)用采集軟件，可采集512個(gè)光電二極管接收的能量值。TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），分辨率選擇0.1 nm。

氧化鈥標(biāo)準(zhǔn)品（GBW（E）130122，國(guó)防科技工業(yè)應(yīng)用化學(xué)一級(jí)計(jì)量站），特征波長(zhǎng)見(jiàn)表1。

表1 氧化鈥標(biāo)準(zhǔn)品特征波長(zhǎng)

0.05 mol/L硫酸溶液：量取2.7 mL濃硫酸定容至1 L，得到0.05 mol/L硫酸溶液。

0.06 g/L重鉻酸鉀溶液：稱(chēng)取0.06 g重鉻酸鉀，用0.05 mol/L硫酸溶液定容至1 L，得到0.06 g/L的重鉻酸鉀溶液。

1.2 掃描透過(guò)光譜與吸收光譜

打開(kāi)氘燈，待能量穩(wěn)定后，掃描每個(gè)光電二極管的能量值，E1～E512。將氧化鈥玻璃置于光路中的檢測(cè)池處，穩(wěn)定幾秒后，再次掃描每個(gè)光電二極管的能量值，得到E1'～E512'。若待測(cè)物為溶液，則先將檢測(cè)池內(nèi)充滿(mǎn)空白溶液并掃描能量值，之后充滿(mǎn)待測(cè)溶液并掃描能量值。利用公式（1）計(jì)算得到透過(guò)率T1～T512，或利用公式（2）得到吸光度A1～A512。以二極管編號(hào)為橫坐標(biāo)，透過(guò)率Tn或吸光度An為縱坐標(biāo)作圖，即獲得待測(cè)物的透過(guò)光譜或吸收光譜。

1.3 波長(zhǎng)校準(zhǔn)原理

利用分光光度計(jì)或查閱相關(guān)文件得到光源發(fā)射光譜和物質(zhì)的吸收或透過(guò)光譜的特征峰波長(zhǎng)，然后利用二極管陣列檢測(cè)器獲得特征峰的二極管編號(hào)，再根據(jù)特征波長(zhǎng)值和二極管編號(hào)擬合出二者的函數(shù)關(guān)系。利用此方程就可將二極管編號(hào)轉(zhuǎn)化為準(zhǔn)確的波長(zhǎng)值，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)檢測(cè)器波長(zhǎng)的校準(zhǔn)。由此過(guò)程可見(jiàn)，特征波長(zhǎng)值的選擇以及方程的擬合方式會(huì)影響到波長(zhǎng)校準(zhǔn)的結(jié)果。

1.4 波長(zhǎng)校準(zhǔn)評(píng)價(jià)指標(biāo)

波長(zhǎng)校準(zhǔn)的結(jié)果可以用具有特征吸收峰的溶液進(jìn)行評(píng)價(jià)，但這需要將溶液輸送至檢測(cè)池內(nèi)。為了簡(jiǎn)化操作，可以選用氘燈發(fā)射光譜和鈥玻璃的吸收光譜對(duì)波長(zhǎng)校準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括：校準(zhǔn)結(jié)果的平均偏差（average deviation，AD）、偏差標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）和均方根誤差（root mean square error，RMSE）。平均偏差可用于評(píng)價(jià)校準(zhǔn)結(jié)果準(zhǔn)確性的平均水平，偏差標(biāo)準(zhǔn)差可用于評(píng)價(jià)校準(zhǔn)結(jié)果偏差的離散性，均方根誤差可用于評(píng)價(jià)校準(zhǔn)結(jié)果偏離標(biāo)準(zhǔn)值的程度，對(duì)較大或較小的偏差比較敏感。

2 結(jié)果與討論

2.1 確定氧化鈥玻璃的特征波長(zhǎng)

氧化鈥標(biāo)準(zhǔn)品外形尺寸與比色皿相同，一般用于校準(zhǔn)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)，通常不適合安裝到液相色譜檢測(cè)器內(nèi)，因此選用外形尺寸可定制的氧化鈥玻璃作為波長(zhǎng)校準(zhǔn)的物質(zhì)。利用分光光度計(jì)獲得的氧化鈥標(biāo)準(zhǔn)品和氧化鈥玻璃的透過(guò)率曲線(xiàn)如圖2所示，從圖中讀取峰值所對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)值，并與氧化鈥標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)上的認(rèn)定值比較，結(jié)果表明，氧化鈥標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)特征波長(zhǎng)值與認(rèn)定值的偏差在0.6 nm以?xún)?nèi)，氧化鈥標(biāo)準(zhǔn)品和氧化鈥玻璃的特征波長(zhǎng)值偏差在0.2 nm以?xún)?nèi)，因此氧化鈥玻璃可以用于波長(zhǎng)校準(zhǔn)?？紤]到分光光度計(jì)的偏差，所選用的特征波長(zhǎng)值=認(rèn)定值–（標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)測(cè)波長(zhǎng)值–氧化鈥玻璃實(shí)測(cè)波長(zhǎng)值）。

圖2 氧化鈥標(biāo)準(zhǔn)品和氧化鈥玻璃的透過(guò)率曲線(xiàn)

2.2 波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)值的選擇對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果的影響

利用光電二極管陣列檢測(cè)器多色儀獲得的特征波長(zhǎng)陣列編號(hào)和對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)值見(jiàn)表2。

表2 實(shí)測(cè)特征波長(zhǎng)陣列編號(hào)和對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)值

采用4種標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)的取值方式對(duì)波長(zhǎng)值y和陣列編號(hào)x進(jìn)行線(xiàn)性擬合，得到的校準(zhǔn)函數(shù)如表3所示。

將表2中的陣列編號(hào)代入表3的4個(gè)函數(shù)關(guān)系中，計(jì)算各校準(zhǔn)后波長(zhǎng)值的平均偏差（AD）、偏差標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和均方根誤差（RMSE），結(jié)果見(jiàn)表4。

對(duì)于取值方式1和2來(lái)說(shuō)，只使用了氧化鈥玻璃的特征波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行線(xiàn)性擬合校準(zhǔn)，因此只在所選取的波長(zhǎng)范圍內(nèi)校準(zhǔn)結(jié)果較好，而在選取的特征波長(zhǎng)區(qū)間之外，如656.1 nm附近的校準(zhǔn)偏差較大。同理，取值方式3只使用了氘燈的兩個(gè)特征波長(zhǎng)進(jìn)行校準(zhǔn)，導(dǎo)致400 nm以下的校準(zhǔn)結(jié)果偏差較大。與取值方式1～3相比，取值方式4選擇了氧化鈥玻璃的6個(gè)特征波長(zhǎng)和氘燈的2個(gè)特征波長(zhǎng)進(jìn)行校準(zhǔn)，在240～650 nm范圍內(nèi)的SD和RMSE均較小，說(shuō)明此取值方式的校準(zhǔn)結(jié)果偏差比較均衡。

從實(shí)際使用考慮，將全波長(zhǎng)范圍內(nèi)的波長(zhǎng)偏差控制在一個(gè)合理值以?xún)?nèi)，要優(yōu)于波長(zhǎng)偏差分布不均的情況。此類(lèi)檢測(cè)器的波長(zhǎng)范圍通常在190～800 nm，理論上，校準(zhǔn)用的波長(zhǎng)值應(yīng)包括190 nm以下和800 nm以上才能保證全波長(zhǎng)范圍的準(zhǔn)確性，但這樣會(huì)增加校準(zhǔn)源的成本，并且需要檢測(cè)器能夠檢測(cè)到波長(zhǎng)值小于190 nm和大于800 nm的光譜，同樣會(huì)增加儀器的設(shè)計(jì)難度和研發(fā)成本。綜合考慮，校準(zhǔn)用波長(zhǎng)值確定在241.5～656.1 nm范圍內(nèi)。

表3 4種波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)值取值方式及對(duì)應(yīng)的線(xiàn)性擬合函數(shù)

表4 4種線(xiàn)性擬合函數(shù)的波長(zhǎng)校準(zhǔn)結(jié)果

2.3 函數(shù)的擬合方式對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果的影響

光電二極管陣列檢測(cè)器多色儀內(nèi)的分光元件是平場(chǎng)凹面光柵，理論上這種光柵的線(xiàn)色散是一個(gè)固定值，即焦平面處單位距離的光譜寬度一致。作為光譜的接收元件，光電二極管在陣列上的排布理論上是等間距的，即單位距離的光電二極管個(gè)數(shù)一致。因此，光譜的波長(zhǎng)和光電二極管的陣列編號(hào)之間應(yīng)該是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。但實(shí)際上，由于光柵和二極管陣列的加工存在誤差、光路調(diào)試也可能會(huì)存在一定偏差，所以波長(zhǎng)值和光電二極管的陣列編號(hào)的關(guān)系只是近似線(xiàn)性，這種近似會(huì)降低波長(zhǎng)校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性[9]。

一種優(yōu)化校準(zhǔn)結(jié)果的方式是采用高次擬合函數(shù)。若對(duì)氧化鈥玻璃的6個(gè)特征波長(zhǎng)和氘燈2個(gè)特征波長(zhǎng)分別采用二次和三次函數(shù)擬合方式，可分別得到函數(shù)關(guān)系5：

函數(shù)關(guān)系6：

函數(shù)關(guān)系5和函數(shù)關(guān)系6中的二次項(xiàng)和三次項(xiàng)即是對(duì)校準(zhǔn)過(guò)程中的非線(xiàn)性部分進(jìn)行調(diào)整，其系數(shù)往往很小。利用函數(shù)關(guān)系5和函數(shù)關(guān)系6對(duì)多色儀獲得的氧化鈥玻璃和氘燈特征波長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的陣列進(jìn)行計(jì)算，得到的校準(zhǔn)后波長(zhǎng)值與特征波長(zhǎng)值的偏差，同時(shí)與函數(shù)關(guān)系4的線(xiàn)性擬合結(jié)果對(duì)比，見(jiàn)表5。

表5 線(xiàn)性、二次曲線(xiàn)和三次曲線(xiàn)擬合函數(shù)的波長(zhǎng)校準(zhǔn)結(jié)果對(duì)比

由表中對(duì)比可以看出，當(dāng)使用同一組校準(zhǔn)波長(zhǎng)值時(shí)，高次擬合函數(shù)方程的校準(zhǔn)結(jié)果要優(yōu)于線(xiàn)性擬合，且三次函數(shù)擬合的結(jié)果優(yōu)于二次函數(shù)擬合的結(jié)果。盡管可以采用更高次的函數(shù)擬合結(jié)果進(jìn)行波長(zhǎng)校準(zhǔn)，但這會(huì)增加校準(zhǔn)過(guò)程的復(fù)雜性，且三次函數(shù)擬合校準(zhǔn)結(jié)果的準(zhǔn)確性對(duì)于多數(shù)紫外吸收型檢測(cè)器來(lái)說(shuō)已經(jīng)足夠。

另一種優(yōu)化校準(zhǔn)結(jié)果的方式是對(duì)陣列數(shù)進(jìn)行開(kāi)方處理，然后利用高次函數(shù)擬合方程進(jìn)行校準(zhǔn)。若對(duì)氧化鈥玻璃的6個(gè)特征波長(zhǎng)和氘燈2個(gè)特征波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的陣列數(shù)進(jìn)行開(kāi)平方處理，然后采用三次函數(shù)擬合進(jìn)行校準(zhǔn)，得到函數(shù)關(guān)系7：

計(jì)算得到的AD為6.55×10-4nm，SD為0.61 nm，RMSE為0.57 nm，SD和RMSE介于函數(shù)關(guān)系5和函數(shù)關(guān)系6的校準(zhǔn)結(jié)果之間，同樣優(yōu)于函數(shù)關(guān)系4的校準(zhǔn)結(jié)果。實(shí)際上，由于對(duì)陣列數(shù)進(jìn)行了開(kāi)平方處理，此時(shí)的函數(shù)關(guān)系7相當(dāng)于在函數(shù)關(guān)系4的基礎(chǔ)上增加1.5次項(xiàng)和0.5次項(xiàng)，所以此時(shí)的函數(shù)關(guān)系7比函數(shù)關(guān)系4能夠更精確地描述陣列和波長(zhǎng)的關(guān)系。如果對(duì)陣列數(shù)開(kāi)高次方，其校準(zhǔn)結(jié)果也會(huì)優(yōu)于開(kāi)平方的結(jié)果，但同樣會(huì)增加校準(zhǔn)過(guò)程的復(fù)雜性，開(kāi)平方的擬合校準(zhǔn)結(jié)果已經(jīng)能夠滿(mǎn)足一般的校準(zhǔn)需求。

2.4 波長(zhǎng)校準(zhǔn)結(jié)果的驗(yàn)證

使用校準(zhǔn)用的特征波長(zhǎng)值對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)能夠在一定程度上反映校準(zhǔn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，但仍需要選擇其他的物質(zhì)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。重鉻酸鉀溶液在紫外區(qū)有4個(gè)特征波長(zhǎng)，可以用來(lái)驗(yàn)證波長(zhǎng)校準(zhǔn)的結(jié)果。

空白選擇0.05 mol/L硫酸溶液，重鉻酸鉀溶液作為樣品，得到的吸收光譜圖如圖3所示，3次掃描的結(jié)果基本重復(fù)。對(duì)實(shí)驗(yàn)中4個(gè)特征波長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的陣列編號(hào)計(jì)算平均值，將其代入到函數(shù)關(guān)系5～7中，如表6所示。校準(zhǔn)后的波長(zhǎng)偏差的絕對(duì)值均不大于1 nm，因此說(shuō)明3個(gè)函數(shù)關(guān)系均能夠獲得比較準(zhǔn)確的校準(zhǔn)結(jié)果。受多色儀光學(xué)分辨率和樣品特征峰型的影響，3個(gè)函數(shù)關(guān)系的差別、優(yōu)勢(shì)均不明顯，因此實(shí)際使用中需要根據(jù)多色儀系統(tǒng)的光學(xué)參數(shù)選擇合適的校準(zhǔn)函數(shù)。

圖3 紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜圖

3 結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)對(duì)自制光電二極管陣列檢測(cè)器的波長(zhǎng)進(jìn)行校準(zhǔn)，采用偏差平均值、偏差標(biāo)準(zhǔn)差、均方根誤差比較了多種波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)值的取值方式以及多種函數(shù)擬合方式對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果的影響。校準(zhǔn)的比較結(jié)果表明，波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)值覆蓋范圍越廣，波長(zhǎng)校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性越高、偏差分布更均衡，且由于光學(xué)元件加工和調(diào)試過(guò)程存在的誤差，多次函數(shù)擬合的校準(zhǔn)結(jié)果要優(yōu)于線(xiàn)性擬合的結(jié)果，對(duì)陣列進(jìn)行開(kāi)方處理后再校準(zhǔn)，也有利于校準(zhǔn)結(jié)果的改善。但實(shí)際使用中，還需要針對(duì)光學(xué)系統(tǒng)的參數(shù)情況選擇最合適的校準(zhǔn)方式，單純追求高次函數(shù)擬合并不一定適合所有的光學(xué)系統(tǒng)。盡管多點(diǎn)高次函數(shù)擬合的波長(zhǎng)校準(zhǔn)方式能夠?qū)⒍O管陣列編號(hào)和特征波長(zhǎng)值的關(guān)系更加準(zhǔn)確地對(duì)應(yīng)起來(lái)，光柵、探測(cè)器的加工精度控制和光路的設(shè)計(jì)、調(diào)試才是影響波長(zhǎng)校準(zhǔn)結(jié)果的根本因素，同樣需要引起重視。

表6 重鉻酸鉀溶液特征峰校準(zhǔn)后的結(jié)果