蘇志星，何 杰，許文軍，謝建軍，施 慧，王庚申，汪 瑋

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus，以下簡(jiǎn)稱梭子蟹）隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、梭子蟹科、梭子蟹屬，是我國(guó)重要的海水捕撈和養(yǎng)殖品種[1]。野生梭子蟹育肥暫養(yǎng)是從實(shí)踐生產(chǎn)當(dāng)中發(fā)展形成的一種高效利用野生梭子蟹自然資源的生產(chǎn)方式，其主要是利用捕撈旺季（9-11月）海區(qū)自然梭子蟹資源數(shù)量多、價(jià)格低之優(yōu)勢(shì)，使原本殼空肉瘦的梭子蟹經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的人工育肥暫養(yǎng)后而變得體肥膏滿，最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的有效提高[2]。然而，野生梭子蟹在育肥暫養(yǎng)前均需經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸，而目前的運(yùn)輸方式多以蟹體堆疊式盛放為主，這難免致使梭子蟹在運(yùn)輸過(guò)程中受到不同程度的擠壓脅迫。

大量研究表明，水生生物在環(huán)境因子脅迫下機(jī)體中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GTS）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、熱休克蛋白（HSP70）等會(huì)呈規(guī)律性變化，這些生理指標(biāo)已被廣泛用于評(píng)估機(jī)體受環(huán)境脅迫的嚴(yán)重程度[3-7]。迄今為止，已有較多有關(guān)梭子蟹應(yīng)對(duì)饑餓、重金屬、氨氮、干露、高鹽、低溫等脅迫因子的生理響應(yīng)規(guī)律研究[8-13]，而尚未見(jiàn)有關(guān)擠壓脅迫對(duì)梭子蟹生理影響的報(bào)道。鑒于此，本研究將模擬野生梭子蟹的運(yùn)輸過(guò)程開(kāi)展堆疊擠壓脅迫對(duì)梭子蟹SOD、GTS、T-AOC等抗氧化和應(yīng)激指標(biāo)的影響，旨在分析堆疊擠壓脅迫下梭子蟹的生理學(xué)變化規(guī)律，為評(píng)估堆疊擠壓對(duì)梭子蟹的損傷程度以及為今后優(yōu)化野生蟹的運(yùn)輸方法提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。2016年7月下旬在梭子蟹養(yǎng)殖池塘去雄期間用餌料誘釣的方法捕捉、挑選十足完整、體質(zhì)健壯、規(guī)格相近（體質(zhì)量為80.15±8.96 g）的幼蟹800余只，暫養(yǎng)于室內(nèi)水泥池內(nèi)，水深40 cm，連續(xù)增氧，水溫為27±1℃，光照周期為12 L：12 D，暫養(yǎng)期間，每天17：00投喂鮮活野雜魚，投喂量約為蟹總重的8%，投喂2 h后清除殘餌，并換水1/3，暫養(yǎng)3 d后開(kāi)始正式試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 擠壓處理

用橡皮筋逐個(gè)捆扎所有備用梭子蟹的螯足，以防止蟹與蟹之間相互撕咬。同時(shí)準(zhǔn)備3只半徑為20 cm，高為0.8 m的圓柱形塑料筐，模擬海捕蟹裝筐運(yùn)輸?shù)姆绞?，將所有捆扎好的梭子蟹分層平鋪于塑料筐中，每筐排?0層梭子蟹（依次為L(zhǎng)1，L2，L3……L20，如圖1所示），每層排列15只，再將塑料筐整體放入一水深為1 m的水泥池內(nèi)，連續(xù)充氧。分別于實(shí)驗(yàn)起始后的0 h、12 h、24 h、36 h、48 h取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從每筐的 L1（無(wú)擠壓）、L5（輕度擠壓）、L10（中度擠壓）、L15（較重度擠壓）、L20（重度擠壓）中隨機(jī)各取1只蟹，用于解剖和生化分析。（補(bǔ)充說(shuō)明：為方便取樣，將每筐中的L2-L4、L6-L9、L11-L14、L16-L19 的蟹分別裝于 4 個(gè)網(wǎng)袋內(nèi)，L1、L5、L10、L15、L20 分別裝于 5 個(gè)網(wǎng)袋內(nèi)，每次以網(wǎng)袋為單位從塑料筐中存取，并從相應(yīng)的網(wǎng)袋中采集樣品蟹。）

圖1 梭子蟹擠壓排布示意圖Fig.1 Diagram of extrusion arrangement of P.trituberculatus hepatopancreas

1.2.2 抗氧化和應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定

將樣品蟹放在冰盤上冷凍麻醉，剝開(kāi)蟹殼后迅速取出肝胰腺，并裝入5mL的離心管后保存于-80℃超低溫冰箱中，備用于檢測(cè)抗氧化和應(yīng)激指標(biāo)。稱取約0.2 g的肝胰腺，加入1mL（W/V=1:5）預(yù)冷的生理鹽水后，用微型勻漿器勻漿30 s后在4℃，12 000 r/min條件下離心20min，取中間清液再次離心，取中間清液用于后續(xù)分析。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定肝胰腺中的超氧化歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）活力、總抗氧化（T-AOC）能力、丙二醛（MDA）含量以及熱休克蛋白（HSP70）表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Levene方法進(jìn)行方差齊次性檢測(cè)。當(dāng)不滿足使用齊性方差時(shí)進(jìn)行反正弦或平方根處理，用T檢驗(yàn)檢查兩群體各指標(biāo)間的差異性，采用sigmaplot 10.0軟件繪圖，取P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中SOD活力的影響

從圖2可以看出，擠壓脅迫處理后，蟹體肝胰腺中的SOD活力發(fā)生顯著變化，總體表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢(shì)，且在擠壓時(shí)間為36 h時(shí)達(dá)到最高。無(wú)擠壓組、輕度擠壓組組間和組內(nèi)SOD活力不會(huì)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而表現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）；中度擠壓組在擠壓時(shí)間達(dá)到36 h時(shí)SOD活力與擠壓前相比發(fā)生顯著性變化（P<0.05）；較重度擠壓實(shí)驗(yàn)組在擠壓后第12 h SOD活力顯著性升高（P<0.05），并在36 h達(dá)到最高，之后又恢復(fù)到擠壓前水平（P>0.05）；重度擠壓組在脅迫處理后SOD活力顯著性升高（P<0.05），且在36 h達(dá)到最高，之后又有所下降。從圖2還可以看出，相同擠壓時(shí)間內(nèi)受擠壓程度較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)組與受擠壓程度較輕組中SOD活力存在差異，前者大于后者，且在36 h時(shí)這種差異最為明顯。

2.2 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中GST活力的影響

擠壓脅迫處理后蟹體肝胰腺中的GST活力變化明顯（圖3），總體表現(xiàn)出隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而升高的趨勢(shì)，且在48 h時(shí)達(dá)到最高。無(wú)擠壓組、輕度擠壓組組間和組內(nèi)GST活力隨著擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著性差異（P>0.05）；較重度擠壓組和重度擠壓組中GST活力與擠壓前變化顯著（P<0.05），且在48 h活力達(dá)到最高。同時(shí)從圖3中可以明顯看出，相同擠壓時(shí)間內(nèi)，較重度擠壓組、重度擠壓組中GST活力明顯高于無(wú)擠壓組、輕度擠壓組，且隨著擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)這種差異越明顯（P<0.01）。

2.3 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中T-AOC水平的影響

擠壓脅迫導(dǎo)致蟹體肝胰腺中T-AOC水平變化顯著（圖4）。較低擠壓強(qiáng)度下無(wú)擠壓組、輕度擠壓組中T-AOC水平隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)有所升高但變化不明顯（P>0.05），且各組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。較重度擠壓組、重度擠壓組蟹體中T-AOC水平隨擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著性差異（P<0.01），總體表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，在36 h時(shí)達(dá)到最低，之后有所回升但與擠壓前依然差異顯著（P<0.05）。從圖4可以看出，在擠壓時(shí)間為36 h和48 h時(shí)，較重度擠壓組、重度擠壓組蟹體中T-AOC水平顯著低于無(wú)擠壓組、輕度擠壓組（P<0.05），且T-AOC水平呈下降趨勢(shì)。

圖2 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中SOD活力的影響Fig.2 Variations of SOD activities in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

圖3 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中GST活力的影響Fig.3 Variations of GST activities in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

2.4 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中MDA含量的影響

擠壓強(qiáng)度和擠壓時(shí)間對(duì)蟹體肝胰腺中MDA含量有顯著性影響（P<0.05）（圖5）。無(wú)擠壓組、輕度擠壓組蟹體中各擠壓時(shí)間段之間MDA含量沒(méi)有發(fā)生明顯變化，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)MDA含量微弱增長(zhǎng)；中度擠壓組蟹體中MDA含量一直上升，在48 h達(dá)到最高；較重度擠壓組、重度擠壓組蟹體中MDA含量先上升后下降，在36 h時(shí)達(dá)到最高且與擠壓前相比存在顯著性差異（P<0.05），之后恢復(fù)到擠壓前水平。從圖5還可以看出，12 h、24 h、36 h中高擠壓強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)組MDA含量與低擠壓強(qiáng)度組存在顯著性差異（P<0.05），但在48 h后差異性消失（P>0.05）。

2.5 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中HSP70表達(dá)量的影響

從圖6可以看出，擠壓強(qiáng)度和擠壓時(shí)間對(duì)蟹體肝胰腺中HSP70表達(dá)量有顯著影響（P<0.05）。無(wú)擠壓組中HSP70表達(dá)量隨著擠壓時(shí)間先升高后降低，在24 h達(dá)到最高且與擠壓前水平有顯著差異（P<0.05），而輕度擠壓組則先降低后升高，在48 h時(shí)達(dá)到最大且與擠壓前存在顯著性差異（P>0.05）；中度擠壓組和較重度擠壓組中HSP70表達(dá)量隨著擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降之后在上升，在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，與擠壓前存在顯著差異（P<0.05）；重度擠壓組中HSP70表達(dá)量表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)，并在36 h時(shí)達(dá)到最大，與擠壓前差異明顯（P<0.05）。同時(shí)，在相同擠壓時(shí)間內(nèi)不同擠壓強(qiáng)度組之間存在顯著性差異（P<0.05）。

圖4 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中T-AOC的變化Fig.4 Variations of T-AOC level in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

圖5 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中MDA含量的影響Fig.5 Variations of MDA contents in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

圖6 擠壓脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中HSP70表達(dá)量的影響Fig.6 Variations of HSP70 expression in P.trituberculatus hepatopancreas during extrusion-stress

大量研究表明，肝胰腺是梭子蟹主要的營(yíng)養(yǎng)代謝和解毒器官，也是對(duì)外界脅迫刺激反應(yīng)最早、最敏感的組織[11]；SOD是一種抗氧化酶，能夠?qū)Ｒ恍缘那宄龣C(jī)體內(nèi)的有害自由基，解除自由基氧化而造成的機(jī)體損害，維持機(jī)體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡，活性氧自由基（ROS）作為SOD的催化底物，二者的含量密切相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在擠壓脅迫作用下蟹體肝胰腺中的SOD活力發(fā)生顯著變化，總體上，除無(wú)擠壓組外，其余各擠壓強(qiáng)度組均表現(xiàn)出隨著擠壓程度的加強(qiáng)和擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活力呈現(xiàn)明顯的先升高后降低的變化趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樗笞有吩跀D壓脅迫下代謝異常以致體內(nèi)ROS急劇增多，引起機(jī)體的氧化應(yīng)激，在自由基的誘導(dǎo)和機(jī)體的代償應(yīng)激下，SOD活力顯著增高，即在0～36 h內(nèi)各組SOD含量均顯著上升，而隨著機(jī)體內(nèi)高濃度ROS對(duì)SOD的大量消耗和機(jī)體本身代償應(yīng)激的消失，SOD活力迅速回落到處理前水平，使得36 h后SOD活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，整體上與王麗等[9]、姜娜等[11]研究的干露和重金屬脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺SOD活力影響的規(guī)律一致，說(shuō)明這是梭子蟹應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)表現(xiàn)出共有的生理響應(yīng)特征。

3 討論

GST和SOD功能相似，都是一種抗氧化酶，其活力與SOD密切相關(guān)[14]。GST作為一種重要的解毒物質(zhì)在肝臟中含量豐富，SOD可以將ROS轉(zhuǎn)化成過(guò)氧化氫（H2O2），但H2O2對(duì)細(xì)胞依然具有強(qiáng)烈的氧化作用，而GST可以將H2O2催化分解為對(duì)機(jī)體無(wú)害的H2O，同時(shí)GST也可以清除機(jī)體內(nèi)的自由基，將有毒的疏水化合物變成清水化合物排除體外[15]。在本研究中，在擠壓脅迫作用下蟹體肝胰腺中GST活力隨著擠壓程度的加強(qiáng)和擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著性差異，擠壓時(shí)間越長(zhǎng)GST活力越強(qiáng)，且GST活力與擠壓強(qiáng)度與呈正相關(guān)，并與無(wú)擠壓脅迫組有顯著差異，表明在擠壓脅迫下GST活性受到誘導(dǎo)而升高，從而提高消除大量H2O2對(duì)機(jī)體的毒害作用。

T-AOC代表了機(jī)體內(nèi)總體抗氧化水平，分為酶性和非酶性兩種。T-AOC可清除自由基和活性氧，其含量多少直接地反映機(jī)體的抗氧化酶活力高低，間接地反映出細(xì)胞受氧化損傷程度大小[16]。本研究中擠壓脅迫作用下蟹體中T-AOC水平隨擠壓程度的加強(qiáng)和擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著變化，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中輕度擠壓組蟹體肝胰腺中T-AOC水平?jīng)]有顯著變化；在中度擠壓組、較重度擠壓組和重度擠壓組蟹體肝胰腺中T-AOC水平均隨擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降，在36 h后較穩(wěn)定。這可能是因?yàn)檩p度擠壓脅迫組引起蟹體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體內(nèi)活性氧增高，肝胰腺組織反饋性的增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)的活力，以維持機(jī)體平衡，而高擠壓強(qiáng)度脅迫超過(guò)了蟹體自身調(diào)控的閾值，抗氧化物質(zhì)體系不斷地被消耗。王麗等[9]在研究水體Cu2＋對(duì)三疣梭子蟹抗氧化能力的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。

MDA是脂質(zhì)被氧化后的終產(chǎn)物[4]，機(jī)體內(nèi)MDA的含量間接反映出細(xì)胞受自由基的氧化損傷程度[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，擠壓脅迫下MDA含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著變化，在0～36 h內(nèi)輕度擠壓組蟹體肝胰腺中MDA含量有所升高但變化不明顯，而較重度擠壓組與重度擠壓組顯著升高后下降，并且達(dá)到峰值的時(shí)間不同，重度擠壓組和較重度擠壓組在第36 h達(dá)到峰值，而重度擠壓組的峰值出現(xiàn)于24 h，這說(shuō)明擠壓脅迫直接引起機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的損傷，且隨著擠壓程度的加重和擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)，“應(yīng)激損傷”程度加劇。至于MDA含量在36 h后出現(xiàn)下降的的可能原因是蟹體對(duì)高擠壓強(qiáng)度的逐漸適應(yīng)，即“應(yīng)激適應(yīng)”。

HSP70作為生物體內(nèi)一種靈敏的應(yīng)激蛋白，其可以有效保護(hù)機(jī)體和細(xì)胞的功能，使機(jī)體免受不利因素的損傷，提高細(xì)胞對(duì)脅迫的耐受性[18]，其表達(dá)量變化直接反映出環(huán)境因子對(duì)生物機(jī)體的影響[5]。正常情況下HSP70在細(xì)胞中呈基礎(chǔ)表達(dá)，表達(dá)水平很低，而在各種有害應(yīng)激狀態(tài)下HSP70合成速度劇增，可在極短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到峰值，以提高機(jī)體適應(yīng)環(huán)境突變的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，不同擠壓強(qiáng)度脅迫對(duì)梭子蟹肝胰腺中HSP70表達(dá)量產(chǎn)生不同的影響，輕度擠壓組蟹體肝胰腺中HSP70表達(dá)量表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，在48 h時(shí)達(dá)到最大值，這可能是因?yàn)槎虝r(shí)間的脅迫作用導(dǎo)致機(jī)體代謝異常和抗應(yīng)激水平降低，而后通過(guò)生理適應(yīng)機(jī)制恢復(fù)至正常水平[11]；中度擠壓組和較重度擠壓組蟹體肝胰腺中的HSP70表達(dá)量隨擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)，可能是在劇烈擠壓脅迫環(huán)境下蟹體內(nèi)短時(shí)間產(chǎn)生大量活性氧，活性氧使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，引發(fā)細(xì)胞程序性死亡，HSP70水平的提高可以阻斷信號(hào)通路，抑制應(yīng)激激酶的活性和蛋白質(zhì)的變性，從而有效減少細(xì)胞的凋亡，顯著改善細(xì)胞的生存能力，所以在擠壓前期，為維持機(jī)體平衡，HSP70基因大量表達(dá)以消除活性氧對(duì)細(xì)胞的損害，隨著擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)，HSP70的大量存在又抑制了HSP70基因的表達(dá)，HSP70的表達(dá)量降低。

4 小結(jié)

綜上，擠壓脅迫將致使梭子蟹肝胰腺中的SOD、GST、T-AOC、MDA以及HSP70這5種指標(biāo)呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，并且變化規(guī)律受擠壓程度的輕重以及擠壓時(shí)間的長(zhǎng)短等因素影響較大，呈現(xiàn)出明顯的程度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)，因此這些指標(biāo)均能夠較敏感地反映出脅迫時(shí)機(jī)體的生理狀態(tài)，為今后優(yōu)化野生蟹的運(yùn)輸方法提供了科學(xué)參考。