朱喜忠 劉子銘 吳術(shù)紅 熊華章 金瑛 李豫皖 楊繼濱 尤奇 劉毅

1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（貴州遵義 563000）

2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科（重慶 400000）

韌帶因自身愈合能力有限，其損傷或病變的治療仍是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)面臨的一大難題[1-3]。據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年有超過(guò)200萬(wàn)例患者因肌腱或韌帶損傷而就診[4]。因此，深入了解韌帶細(xì)胞的分化機(jī)制對(duì)臨床損傷的修復(fù)或重建至關(guān)重要。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs）雖已廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[5,6]，但存在取材創(chuàng)傷大、含量低等缺點(diǎn)[7,8]。而人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）具有取材方便、增殖速度快、不存在倫理限制等優(yōu)點(diǎn)，成為近些年的研究熱點(diǎn)[9-11]。

BMP9（生長(zhǎng)分化因子2,GDF-2）是已知骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphorgenetic proteins，BMPs）家族中誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)和體外成骨分化能力最強(qiáng)的成員[12,13]，但其是否具有誘導(dǎo)干細(xì)胞向肌腱分化的能力還鮮有報(bào)道。最近有研究表明[14]，BMP9同樣可以激活A(yù)LK1和ALK5受體從而增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)使用腺病毒載體系統(tǒng)將人BMP9基因?qū)肴搜蚰らg充質(zhì)干細(xì)胞中，探討B(tài)MP9能否誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向韌帶細(xì)胞定向分化，并研究其分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑、儀器

實(shí)驗(yàn)所搜集5個(gè)胎盤(pán)來(lái)自于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科足月產(chǎn)產(chǎn)婦，無(wú)其他基礎(chǔ)疾病，術(shù)前均簽署知情同意書(shū)，符合遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)要求。實(shí)驗(yàn)所搜集3例前交叉韌帶殘端來(lái)自于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者，術(shù)前簽署知情同意書(shū)，符合遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)要求。

L-谷氨酰胺、L-DMEM/F12培養(yǎng)液（GIBCO公司，美國(guó)）；胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶（HYCLONE公司，美國(guó)）；轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green real-time PCR Master Mix（TAKARA公司，日本）；AdBMP9表達(dá)質(zhì)粒、AdGFP空載對(duì)照質(zhì)粒（上海漢恒生物科技有限公司）；青霉素、鏈霉素（華北制藥有限公司）；Trizol試劑（Invetrogen公司，美國(guó)）；Ⅰ型膠原抗體（Abcam公司，英國(guó)）；4%多聚甲醛固定液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）、山羊抗兔 cy3熒光二抗、Triton X-100、山羊血清（北京索萊寶科技有限公司）。

超凈工作臺(tái)（北京冠鵬凈化設(shè)備公司）；冷凍離心機(jī)（EPPENDORF公司，德國(guó)）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；CO2恒溫箱（THERMOSCIENTIFIC公司，美國(guó)）。CFX96型實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

1.2 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

根據(jù)本課題組建立的方法分離培養(yǎng)hAMSCs。主要如下：將羊膜從胎盤(pán)上剝離，PBS液沖洗干凈后剪成碎片，0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化2次，PBS液洗滌后，0.75 mg/mLⅡ型膠原酶消化3 h，收集細(xì)胞濾液，以1500 rpm、4℃離心6 min。棄上清，用含10%FBS的L-DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞、計(jì)數(shù)并接種，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 人交叉韌帶成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

根據(jù)本課題組建立的酶消化法分離培養(yǎng)韌帶成纖維細(xì)胞（Ligament fibroblast cells,LFs），主要如下：將ACL殘端在PBS液中反復(fù)洗滌，剔除多余結(jié)締組織，0.2%的Ⅰ型膠原酶在37℃水浴箱中震蕩消化5 h，收集細(xì)胞濾液，以1500 rpm、4℃離心6 min。棄上清，用含10%FBS的L-DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞、計(jì)數(shù)并接種，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 AdBMP9體外轉(zhuǎn)染hAMSCs

基于AdMAX系統(tǒng)[pHBAd穿梭質(zhì)粒、腺病毒骨架載體pBHGlox（deltaΔE1,3Cre）雙載體組成]，將構(gòu)建的帶有目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒經(jīng)大量抽提（濃度＞1 mg/ml、A260/280 在 1.7～1.8之間）后，于293A細(xì)胞中進(jìn)行包裝（體系：目的基因質(zhì)粒：pBHGlox（deltaΔE1,3Cre）=1∶2）后行篩取、擴(kuò)增與純化，純化采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法。隨后使用293細(xì)胞對(duì)病毒進(jìn)行梯度法稀釋后培養(yǎng)8 h后觀察綠色熒光表達(dá)量，進(jìn)行病毒滴度（PFU/ml）的測(cè)定。

取P3代匯合率50%～75%之間的hAMSCs，棄去培養(yǎng)基后使用PBS洗滌3遍，更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基后，分別添加不同梯度（MOI=3、10、30、100、300；感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）AdBMP9和等滴度同體積的AdGFP，輕搖培養(yǎng)板使其分布均勻，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h后更換為含10%FBS的L-DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后觀察熒光表達(dá)量并計(jì)算合適的MOI值。

取P3代匯合率50%～75%之間的hAMSCs，棄去培養(yǎng)基后使用PBS洗滌3遍，更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基后添加MOI=10的AdBMP9和AdGFP，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h后更換為含10%FBS的LDMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，此后每48 h換液[15]。

1.5 觀測(cè)指標(biāo)

1.5.1 hAMSCs和LFs的比較

倒置相差顯微鏡觀察：原代培養(yǎng)24 h后和P3代培養(yǎng)24 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。

1.5.2 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

①倒置相差顯微鏡觀察：轉(zhuǎn)染后8 h、24 h于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。②熒光顯微鏡觀察：轉(zhuǎn)染后8 h、24 h于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)分組

A組：攜帶綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）的空腺病毒載體轉(zhuǎn)染hAMSCs（hAMSCs-GFP）；B組：攜帶BMP9基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染hAMSCs（hAMSCs-BMP9）；C組：韌帶成纖維細(xì)胞組（LFs）。所有實(shí)驗(yàn)分組材料均按照上述所制備。各組細(xì)胞體外培養(yǎng)7天后進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.5.4 韌帶相關(guān)分子表達(dá)水平檢測(cè)

①實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：取A、B、C三組細(xì)胞分別于培養(yǎng)7 d時(shí)檢測(cè)SCX、Tnmd、ColⅠ、Fib和TNC的mRNA表達(dá)水平。標(biāo)準(zhǔn)Trizol法提取各組細(xì)胞的RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA提取質(zhì)量。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。引物在NCBI基因庫(kù)中對(duì)比后，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。②熒光免疫組化分析：A、B、C三組細(xì)胞分別以密度為1.5×105/ml的細(xì)胞懸液，加入到含直徑25 mm細(xì)胞爬片的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)7 d后，取出細(xì)胞爬片，按改良Coons細(xì)胞免疫熒光染色步驟操作，一抗孵育過(guò)夜后，加山羊抗兔Cy3檢測(cè)Ⅰ型膠原，熒光顯微鏡觀察。

表1 基因引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

續(xù)表1

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hAMSCs和LFs的形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡觀察：hAMSCs原代時(shí)多呈橢圓或多角形貼壁生長(zhǎng)，部分區(qū)域可見(jiàn)細(xì)胞聚集，細(xì)胞核圓形，排列不規(guī)則；傳代培養(yǎng)后以長(zhǎng)梭形為主，漩渦狀生長(zhǎng)。LFs原代時(shí)多以長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞核圓形，原代數(shù)量較少；傳代后呈明顯長(zhǎng)梭狀生長(zhǎng)，可見(jiàn)漩渦狀集落（圖1）。

圖1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和人韌帶纖維細(xì)胞的形態(tài)（×100）

2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

2.2.1 倒置相差顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染后8 h、24 h鏡下可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖緩慢，輪廓清晰，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化。（圖2A、2B）

2.2.2 熒光顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染后8 h可見(jiàn)明顯GFP熒光表達(dá)；24 h時(shí)表達(dá)GFP細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時(shí)熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)（圖2C、2D）。

圖2 病毒轉(zhuǎn)染人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（×200）

2.3 韌帶相關(guān)分子表達(dá)水平檢測(cè)

2.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

轉(zhuǎn)染7天后，A組表達(dá)SCX、Tnmd、ColⅠ、Fib及TNC均高于B組（P＜0.05），但其SCX、Tnmd、Fib及TNC的表達(dá)量低于C組（P＜0.05），而ColⅠ的表達(dá)量高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后肌腱細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

2.3.2熒光免疫組化分析

體外培養(yǎng)7天后，B組ColⅠ的表達(dá)量均高于A組和C組，C組ColⅠ的表達(dá)量高于A組（P＜0.05）（圖4）。

圖4 免疫熒光檢測(cè)各組Ⅰ型膠原表達(dá)量（×40）

3 討論

與其他來(lái)源的MSCs相比，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材無(wú)創(chuàng)、采集便捷等優(yōu)點(diǎn)[16]，已廣泛應(yīng)用于骨損傷、神經(jīng)性疾病、脊髓損傷等疾病的動(dòng)物模型體內(nèi)研究，對(duì)骨骼肌肉系統(tǒng)損傷的治療具有良好前景[17]。BMPs對(duì)于發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞增殖和分化都發(fā)揮著重要作用，可以調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向骨、軟骨、脂肪和肌腱等方向分化[18]。BMP9作為其家族中成骨分化能力最強(qiáng)的成員，其能否誘導(dǎo)干細(xì)胞向韌帶分化鮮有報(bào)道。這可能與BMP12的研究有關(guān)。BMP12具有較強(qiáng)的成韌帶組織能力[19]，有學(xué)者在兔模型上采用BMP12基因修飾促進(jìn)了后交叉韌帶損傷的組織學(xué)和生物力學(xué)愈合[20]。

傳統(tǒng)的外源性添加誘導(dǎo)因子能夠誘導(dǎo)MSCs向肌腱樣細(xì)胞分化[11]，但直接添加外源性生長(zhǎng)因子具有價(jià)格昂貴、發(fā)揮生物活性時(shí)間短、局部濃度不確定等缺點(diǎn)[8]。故本研究通過(guò)腺病毒載體系統(tǒng)將人BMP9基因轉(zhuǎn)入hAMSCs，使外源性基因在一定時(shí)間內(nèi)高效表達(dá)[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用BMP9基因修飾hAMSCs后，可明顯促進(jìn)hAMSCs向韌帶成纖維細(xì)胞表型分化并促進(jìn)韌帶特異性基因表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)分泌。但目前尚無(wú)單一的表型標(biāo)記來(lái)鑒定成熟的韌帶成纖維細(xì)胞，因此本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光檢測(cè)，從基因和蛋白水平來(lái)評(píng)價(jià)BMP9基因修飾hAMSCs后促進(jìn)其向韌帶細(xì)胞分化的效果，并與LFs相比較。而本實(shí)驗(yàn)中使用的LFs細(xì)胞取自膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎全膝置換術(shù)患者，故肌腱細(xì)胞的增殖和特異性分子表達(dá)能力能否代表正常肌腱細(xì)胞還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor beta，TGF-β）超家族為現(xiàn)階段韌帶組織工程中的熱點(diǎn)因子，包括TGF-β1（transforming growth factor beta 1）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）家族，而其對(duì)種子細(xì)胞的誘導(dǎo)作用和途徑卻不盡相同[21]。TGF-β1主要通過(guò)介導(dǎo)ALK5的Ⅰ型受體或ALK1受體激活Smad2/3途徑從而促進(jìn)細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成[22]，而B(niǎo)MPs家族對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)和分化效果主要通過(guò)介導(dǎo)ALK2、ALK3和ALK6受體，且不同的BMPs家族亞型對(duì)不同來(lái)源的細(xì)胞誘導(dǎo)效果也不一樣[23]。如BMP12因其具有較強(qiáng)的纖維誘導(dǎo)作用被應(yīng)用于腱骨愈合的研究，而B(niǎo)MP6或BMP7卻抑制種子細(xì)胞的纖維化。Herrera等[24]發(fā)現(xiàn)，BMP9作為T(mén)GF-β1Ⅰ型受體ALK1的聯(lián)合配體并激活Smad1/5/8途徑促使內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞及肝癌細(xì)胞纖維化。不僅如此，Munoz等[14]發(fā)現(xiàn)BMP9還可激活Smad2/3及MAPK/ErK1/2受體從而增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的合成及種子細(xì)胞纖維化。既往研究表明ErK1/2被抑制后會(huì)降低BMP9的成骨分化效應(yīng)，而B(niǎo)MP9刺激內(nèi)皮細(xì)胞后會(huì)激活MAPK/ErK1/2受體，這說(shuō)明MAPK/ErK1/2對(duì)于BMP9誘導(dǎo)種子細(xì)胞分化可能是另一個(gè)重要的途徑[25]。然而B(niǎo)MP9與TGF-β1并不具有協(xié)同作用。Herrera等人還發(fā)現(xiàn)，盡管兩種因子同時(shí)作用后比分別單獨(dú)使用TGF-β1誘導(dǎo)增強(qiáng)了CAGA啟動(dòng)子的激活，比單獨(dú)使用BMP9誘導(dǎo)減弱了BRE元件的激活，而對(duì)于Smad1/5/8和Smad2/3的激活效應(yīng)卻沒(méi)有增強(qiáng)。更值得注意的是，經(jīng)BMP9轉(zhuǎn)染后的干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中額外添加TGF-β1誘導(dǎo)因子復(fù)合誘導(dǎo)后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一型膠原及纖維連接蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯改變，這說(shuō)明BMP9與TGF-β1之間可能存在受體競(jìng)爭(zhēng)作用[14]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染7天后，B組中SCX、Tnmd、CoⅠ、Fib及TNC的mRNA表達(dá)量均高于A組（P＜0.05）。SCX作為肌腱和韌帶發(fā)生和發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與肌腱祖細(xì)胞的聚集及分化[26,27]。Ⅰ型膠原是肌腱和韌帶細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，其對(duì)肌腱和韌帶的強(qiáng)度至關(guān)重要[28]。Tnmd是肌腱分化的特異性標(biāo)記，主要在肌腱和韌帶以及骨骼肌的肌外膜中表達(dá)[29]。另一方面，轉(zhuǎn)染7天后，B組SCX、Tnmd、Fib及TNC的mRNA表達(dá)量仍顯著低于C組（P＜0.05）。這可能與BMP9的誘導(dǎo)分化能力及時(shí)間有關(guān)。但B組CoⅠ的mRNA表達(dá)量顯著高于C組（P＜0.05），此結(jié)果相同于熒光免疫組化分析。這可能由多方面因素造成，一是LFs來(lái)源問(wèn)題（OA患者）而導(dǎo)致ColⅠ表達(dá)量降低，有研究證明LFs在體外分離培養(yǎng)過(guò)程時(shí)，其培養(yǎng)周期較長(zhǎng)且增殖能力較弱[30]；二是hAMSCs經(jīng)BMP9誘導(dǎo)后確實(shí)明顯增加了ColⅠ的表達(dá)量，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究將人BMP9基因成功轉(zhuǎn)染人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，并誘導(dǎo)其成韌帶細(xì)胞分化取得了一定效果，為hAMSCs作為韌帶組織工程種子細(xì)胞提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為BMP9基因作用的研究提供了新的方向。