雷清瑤

中藥雞骨草為豆科相思子屬植物廣東相思子(abrus cantoniensis hance)的干燥全草, 其主要活性成分為生物堿類(lèi)和黃酮類(lèi)物質(zhì)。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為, 雞骨草具有疏肝止痛、清熱解毒等功效, 現(xiàn)代藥理研究表明雞骨草具有促進(jìn)脂質(zhì)代謝、抗氧化應(yīng)激、改善肝功能等作用, 對(duì)急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛等療效明確［1,2］。既往研究表明, 雞骨草提取物對(duì)NAFLD大鼠肝組織具有改善調(diào)節(jié)作用, 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)喂養(yǎng)大鼠高脂飼料以建立NAFLD模型, 觀察雞骨草對(duì)NAFLD大鼠肝組織ROCK、CD14表達(dá)水平的影響, 為肝損傷的臨床診療提供參考, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠32只, 均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 體質(zhì)量220～250 g。實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。采用隨機(jī)數(shù)字法將32只大鼠分為對(duì)照組、模型組、辛伐他汀組、雞骨草水提取物組, 每組8只。

1.2 主要藥物、試劑與儀器 雞骨草(廣州康臣藥業(yè)有限公司)；核酸染料(北京賽百盛公司)；上樣緩沖液、去核糖核酸酶水、Total RNA提取試劑(大連寶生物工程有限公司)；山羊抗大鼠ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz生物工程公司)；免疫組化學(xué)試劑盒(武漢博士德生物工程公司)；Trizol試劑盒(美國(guó)invitrogen公司)；RT-PCR試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)；核酸蛋白分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。

1.3 脂肪乳劑的制備 取市售一級(jí)豬油500 g, 置于高溫加熱, 直至融化, 后加入膽固醇180 g、吐溫-80 50 ml, 冷卻液化成油相；將160 g蔗糖、100 g全脂奶粉、40 g丙二醇加入500 ml蒸餾水中, 加熱至70℃后加入20 g脫氧膽酸鈉, 充分?jǐn)嚢? 混合均勻成水相；將水相沿杯壁緩倒入油相, 攪拌均勻,置冷卻后于4℃低溫保存, 灌胃時(shí)55℃水浴溶化至可吸取。

1.4 雞骨草提取物的制備 取雞骨草全草, 以10倍體積的水作為溶劑, 首次以10倍水浸泡雞骨草1 h、煮沸2 h, 取提取液；第2次以5倍水煮雞骨草1 h, 取提取液, 合并兩次提取液, 加熱濃縮至5 g/ml, 置于5℃低溫保存。

1.5 動(dòng)物造模方法及給藥方法

1.5.1 動(dòng)物造模 按NAFLD造模方法, 除對(duì)照組外, 每天早晨8∶00各組均10 ml/kg予以脂肪乳劑灌胃喂養(yǎng), 對(duì)照組予以等容積生理鹽水, 光照時(shí)間為12 h/d, 溫度控制在22℃, 持續(xù)喂養(yǎng)8周。參照《非酒精性脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)》, 根據(jù)肝小葉內(nèi)脂肪變的肝細(xì)胞數(shù)將脂肪肝程度進(jìn)行分級(jí)：F0：0～5%肝細(xì)胞脂肪變；F1：5%～30%肝細(xì)胞脂肪變；F2：31%～50%肝細(xì)胞脂肪變；F3：51%～75%肝細(xì)胞脂肪變；F4：＞75%肝細(xì)胞脂肪變。

1.5.2 給藥方法 每天16∶00予以灌藥, 辛伐他汀組按10 mg/kg給予灌藥, 雞骨草水提取物組按5 g/kg給予灌藥,對(duì)照組和模型組予以等容積生理鹽水, 連續(xù)給藥8周。

1.6 樣品采集與處理、分析 末次給藥后, 各組大鼠均于腹腔注射10%的水合氯醛, 行腹主動(dòng)脈采血, 采用3000 r/min離心10 min, 取血清為樣本, 以試劑盒說(shuō)明書(shū)為參考, 使用生化分析儀檢測(cè)血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

各組大鼠于采血后處死, 采用Trizol試劑盒提取肝組織中總RNA, 取0.5 ml RNA提取液, 以RT-PCR試劑盒將其轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的DNA, 與-70℃低溫保存, 用2%瓊脂糖電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 以溴化乙錠染色, 凝膠成像系統(tǒng)觀察、計(jì)算LBP和CD14表達(dá)量；采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ( -x±s) 表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠血脂水平比較 模型組的TC、TG、LDL-C水平顯著高于對(duì)照組, HDL-C水平顯著低于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；辛伐他汀組、雞骨草水提取物組TC、TG、LDL-C水平顯著低于模型組, HDL-C水平顯著高于模型組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；辛伐他汀組、雞骨草水提取物組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 四組大鼠LBP和CD14表達(dá)水平比較 模型組的LBP和CD14表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；辛伐他汀組、雞骨草水提取物組的LBP和CD14表達(dá)水平均顯著低于模型組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；辛伐他汀組、雞骨草水提取物組LBP和CD14表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 四組大鼠ROCK表達(dá)水平比較 模型組的ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；辛伐他汀組、雞骨草水提取物組的ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ水平顯著低于模型組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；辛伐他汀組、雞骨草水提取物組ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ表達(dá)水平比較, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表1 四組大鼠血脂水平比較 ( ±s)

表1 四組大鼠血脂水平比較 ( ±s)

注：與對(duì)照組比較, aP＜0.05；與模型組比較, bP＜0.05

組別 只數(shù) TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)對(duì)照組 8 3.71±0.51 2.56±0.63 2.68±0.70 1.71±0.38模型組 8 12.45±2.54a 10.75±1.89a 1.12±0.38a 3.87±0.53a辛伐他汀組 8 5.35±1.80b 6.58±1.63b 1.89±0.75b 2.45±0.48b雞骨草水提取物組 8 5.67±1.52b 6.95±1.34b 1.85±0.42b 2.42±0.62b

表2 四組大鼠LBP和CD14表達(dá)水平比較( ±s)

表2 四組大鼠LBP和CD14表達(dá)水平比較( ±s)

注：與對(duì)照組比較, aP＜0.05；與模型組比較, bP＜0.05

組別 只數(shù) CD14 mRNA LBP mRNA對(duì)照組 8 0.715±0.015 0.686±0.016模型組 8 0.998±0.013a 1.072±0.015a辛伐他汀組 8 0.815±0.011b 0.852±0.013b雞骨草水提取物組 8 0.812±0.011b 0.863±0.014b

表3 四組大鼠ROCK表達(dá)水平比較 ( ±s)

表3 四組大鼠ROCK表達(dá)水平比較 ( ±s)

注：與對(duì)照組比較, aP＜0.05；與模型組比較, bP＜0.05

組別 只數(shù) ROCK-Ⅰ ROCK-Ⅱ?qū)φ战M 8 0.001±0.000 0.001±0.000模型組 8 0.354±0.178a 0.396±0.225a辛伐他汀組 8 0.203±0.005b 0.213±0.003b雞骨草水提取物組 8 0.212±0.054b 0.216±0.074b

3 討論

NAFLD是指除酒精和其它明確的損肝因素所致肝臟損害的病理綜合癥, 其主要特征為肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉淀。該病發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜, 與遺傳、環(huán)境、代謝等均有一定關(guān)系［3］。該病具有較高的發(fā)病率, 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì), 我國(guó)NAFLD患病率高達(dá)15%以上, 全球NAFLD的患病率為25%左右, 嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康, 成為全球重要的公共健康問(wèn)題之一。

對(duì)于NAFLD發(fā)病機(jī)制尚未形成統(tǒng)一的觀點(diǎn), 目前已有胰島素抵抗、脂肪儲(chǔ)存失調(diào)、氧化應(yīng)激、基因改變以炎癥因子等多種學(xué)說(shuō)［4,5］。NAFLD均存在內(nèi)毒素(LPS)血癥, LPS須與血漿中LBP結(jié)合, 形成LPS-LBP復(fù)合物, 并通過(guò)脂多糖CD14受體激活相關(guān)因子, 促進(jìn)白細(xì)胞介素6等因子的釋放,進(jìn)而導(dǎo)致脂肪性肝炎, 因此LBP、CD14水平檢測(cè)對(duì)于疾病的診斷具有一定的臨床價(jià)值, Kapil 等［6］也曾論述二者的相關(guān)性。ROCK信號(hào)通路通過(guò)聚合肌動(dòng)蛋白微絲骨架, 進(jìn)而影響著平滑肌細(xì)胞的收縮、粘附、遷移、增值和凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng), 相關(guān)研究也已證實(shí)ROCK介導(dǎo)了肝纖維化的形成,在某種程度上與肝功能密切相關(guān)。

雞骨草的主要活性成分為黃酮類(lèi)和生物堿物質(zhì), 其中黃酮碳苷可通過(guò)減少脂質(zhì)的合成、促進(jìn)脂質(zhì)代謝, 從而對(duì)脂肪肝起到保護(hù)作用［7］, 黃酮類(lèi)化合物多以中濃度乙醇提取, 而高濃度醇提取物則多為藥效作用偏弱的脂類(lèi)、萜類(lèi)物質(zhì)［8］。

本研究結(jié)果顯示, 模型組的TC、TG、LDL-C水平顯著高于對(duì)照組, HDL-C水平顯著低于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；辛伐他汀組、雞骨草水提取物組TC、TG、LDL-C水平顯著低于模型組, HDL-C水平顯著高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；模型組的LBP和CD14表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；辛伐他汀組、雞骨草水提取物組的LBP和CD14表達(dá)水平均顯著低于模型組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)模型組的ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；辛伐他汀組、雞骨草水提取物組的ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ水平顯著低于模型組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。黃凱文等［9］研究證實(shí)了雞骨草提取物可調(diào)節(jié)NAFLD大鼠肝細(xì)胞TLR4/p38 MAP K信號(hào)通路, 發(fā)揮抗炎和改善脂質(zhì)代謝紊亂的作用；黃凱文等［10］還表明雞骨草提取物可影響、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)-1c表達(dá), 對(duì)NAFLD大鼠具有一定治療作用, 與本研究結(jié)果相仿。

綜上所述, 雞骨草對(duì)NAFLD大鼠的治療效果肯定, 猜測(cè)可能與降低CD14和ROCK水平有一定關(guān)系。本試驗(yàn)不足之處在于未對(duì)有關(guān)藥理作用及不良反應(yīng)做進(jìn)一步探討研究, 還有待廣大醫(yī)學(xué)者們做進(jìn)一步、前瞻性深入證實(shí)。