趙 泉，劉艷西，吳 劍 (1.湖北科技學(xué)院，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院第一附屬醫(yī)院，咸寧市中心醫(yī)院，湖北 咸寧 437100)

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis OA)的致病機(jī)理尚未完全明了，但有關(guān)軟骨基質(zhì)的降解已得到共識，目前認(rèn)為與基質(zhì)金屬蛋白酶－9(MMP－9)有關(guān)。它能夠特異性的裂解軟骨基質(zhì)中的膠原分子，破壞軟骨基質(zhì)的膠原網(wǎng)絡(luò)，使軟骨細(xì)胞暴露于炎性因子的攻擊下進(jìn)而出現(xiàn)凋亡［1］。富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)的研究越來越多，其對多種類型細(xì)胞損傷的治療作用良好，有實(shí)驗(yàn)研究表明PRP對軟組織損傷的愈合、韌帶和骨/軟骨的再生、炎性反應(yīng)的消退有促進(jìn)作用［2－3］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)PRP可降低骨關(guān)節(jié)炎動物模型中IL－1β［4］含量。然而，PRP在退行性炎性反應(yīng)的軟骨細(xì)胞中的作用仍不清楚。本文通過觀察富血小板血漿對兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型MMP－9的影響，探討其關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑:注射用青霉素(生產(chǎn)商:華北制藥股份有限公司);氯胺酮注射液(生產(chǎn)商:福建古田藥業(yè)有限公司)。MMP－9檢測試劑盒(生產(chǎn)商:武漢博士得生物有限公司)，MMP－9抗體、山羊抗兔HRP二抗(生產(chǎn)商:上海碧云天生物有限公司)，Olympus光學(xué)顯微鏡(生產(chǎn)商:日本奧林巴斯公司);RM2315切片機(jī)(生產(chǎn)商:德國Leica公司);透射電子顯微鏡(生產(chǎn)商:日本日立公司)。

1.2 富血小板血漿的制備:整個制備過程嚴(yán)格無菌操作，使用10 ml帶19號針頭無菌注射器抽取1 ml 10%枸櫞酸鈉潤管行新西蘭大白兔(萬千佳和實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號:0001647)耳緣靜脈穿刺，抽取血液至10 ml。將血液分別放入15 ml離心管，按Aghaloo法提取富血小板血漿［5］，即第1次離心215×g 10 min，取離心后白膜層以上血漿置于另一離心管，進(jìn)行第2次離心，條件為863×g 10 min，收集上清即貧血小板血漿，移至另一離心管中，剩余0.8 ml吹打均勻即富血小板血漿［(1 958.33±316.41)×109/L］，－80℃冰箱分裝保存?zhèn)溆茫恐煌每商崛「谎“逖獫{(9.6±0.4)ml。

1.3 動物及分組:36只4～5個月齡新西蘭大白兔(武漢市萬千佳禾實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限公司，合格證號:0001647)，體重2.5～3.0 kg，雄雌各半。隨機(jī)將36只大白兔分為對照組、模型組和PRP組(n=12)。按10 mg/kg氯胺酮麻醉后，模型組、PRP組左膝關(guān)節(jié)行改良Hulth術(shù)造模，即行膝內(nèi)側(cè)4 cm的縱行切口，探查膝關(guān)節(jié)無原發(fā)病變后切斷前后交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶，完全切除內(nèi)側(cè)半月板，勿損傷軟骨面，徹底止血，生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，行抽屜試驗(yàn)陽性后逐層縫合關(guān)節(jié)囊、皮膚，無菌紗布包扎，不予固定;對照組僅打開關(guān)節(jié)腔，不損傷韌帶和半月板，縫合皮膚。術(shù)后每天肌內(nèi)注射青霉素40萬U/kg，隔天傷口換藥，觀察傷口情況，連續(xù)7 d預(yù)防感染。根據(jù)超疲勞活動易提前出現(xiàn)OA的發(fā)病特點(diǎn)［6］，手術(shù)后1周，強(qiáng)迫動物每天活動30 min，分兩次驅(qū)趕，4周后即可獲得典型的OA模型。術(shù)后第5周開始，PRP組0.5 ml PRP關(guān)節(jié)腔注射;對照組、模型組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等量生理鹽水，連續(xù)注射6周。

1.4 樣本獲取及指標(biāo)檢測

1.4.1 免疫組織化學(xué)檢測軟骨及滑膜組織中MMP－9表達(dá)量:取股骨內(nèi)髁軟骨修成0.2 cm×0.3 cm×0.3 cm的全層軟骨，10%甲醛固定，系列脫水、脫鈣，石蠟包埋，切片，按免疫組織化學(xué)試劑盒方法檢測軟骨中MMP－9的表達(dá)情況，隨機(jī)選取5個高倍視野下軟骨細(xì)胞及滑膜細(xì)胞中MMP－9陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值，即陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)，并利用圖像分析測量軟件Imagepro－plus計(jì)算平均積分光密度值。

1.4.2 關(guān)節(jié)液及血清中MMP－9含量的測定:造模關(guān)節(jié)脫毛，酒精消毒，5 ml注射器行關(guān)節(jié)腔穿刺，關(guān)節(jié)腔注入1 ml無菌生理鹽水，反復(fù)沖洗后抽出，裝于2 ml離心管中，90 000×g下離心15 min，取上清待檢;取耳中靜脈血液，盛于5ml離心管中，90 000×g下離心15 min，取血清待檢。按試劑盒檢測方法檢測關(guān)節(jié)液及血液中MMP－9含量。

對軟骨與滑膜中MMP－9的陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，對關(guān)節(jié)液中與血清中MMP－9含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS11.9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組間關(guān)節(jié)軟骨及滑膜細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)及平均積分光密度的比較采用單因素方差分析，關(guān)節(jié)液及血液中MMP－9含量采用兩兩比較q檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨組織中基質(zhì)金屬蛋白酶－9的表達(dá)量:對照組軟骨細(xì)胞只見標(biāo)本表層極個別陽性細(xì)胞，見圖1A，PRP組軟骨標(biāo)本的4層結(jié)構(gòu)中，可見到少量胞漿染成深棕色的陽性細(xì)胞，見圖1B。模型組軟骨標(biāo)本的4層結(jié)構(gòu)中，均可見到胞漿染成深棕色的陽性細(xì)胞，見圖1C。各組軟骨細(xì)胞中陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)平均積分光密度值，見表1。

表1 各組軟骨MMP－9表達(dá)情況()

表1 各組軟骨MMP－9表達(dá)情況()

注:與模型組比較，①P＜0.05

組別 陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)(%) 平均積分光密度(aIOD)對照組 15.61±1.23① 0.09±0.02①PRP組 22.39±2.09① 0.13±0.04①模型組71.65±3.25 0.50±0.08

2.2 滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶－9的表達(dá)量:對照組滑膜MMP－9僅在少數(shù)滑膜細(xì)胞中分布，染色淡，散在分布，見圖2A。PRP組中少數(shù)滑膜細(xì)胞組織可見散在分布的淡染的陽性細(xì)胞，在關(guān)節(jié)囊的滑膜下層偶爾見到少數(shù)陽性細(xì)胞，染色均淺，見圖2B。而模型組滑膜細(xì)胞層存在有大量陽性細(xì)胞，染色較深，聚集現(xiàn)象明顯，滑膜下層也可見到大量陽性細(xì)胞，染色較試驗(yàn)組深，甚至可見到染成深褐色的強(qiáng)陽性滑膜細(xì)胞，見圖2C。各組關(guān)節(jié)滑膜MMP－9含量的平均積分光密度與陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)詳見表2。

2.3 各組動物關(guān)節(jié)液中MMP－9濃度測定:顯示對照組為(22.51±1.21)ng/ml，PRP組和模型組關(guān)節(jié)液中MMP－9濃度分別為(45.63±2.96)ng/ml與(84.48±2.36)ng/ml，PRP組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PRP組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3A。對各組動物血清中 MMP－9濃度測定顯示對照組為(4.37±1.32)ng/ml，PRP組和模型組關(guān)節(jié)液中MMP－9濃度分別為(9.87±1.52)ng/ml與(18.82±2.38)ng/ml，PRP 組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PRP組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3B。

2.4 相關(guān)性分析:軟骨與滑膜中MMP－9的陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)高度相關(guān)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖4A，關(guān)節(jié)液中與血清中MMP－9含量成高度正相關(guān)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4B。

表2 各組滑膜中MMP－9表達(dá)情況()

表2 各組滑膜中MMP－9表達(dá)情況()

注:與模型組比較，①P＜0.05

組別 陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)(%) 平均積分光密度(aIOD)對照組 13.68±0.69① 0.15±0.03①PRP組 17.26±0.54① 0.25±0.06①模型組38.24±1.95 0.49±0.07

圖1 圖A:對照組軟骨細(xì)胞MMP－9免疫組化染色(400×);圖B:PRP組軟骨軟骨細(xì)胞MMP－9免疫組化染色(400×);圖C:模型組軟骨細(xì)胞MMP－9免疫組化染色(400×)

圖2 圖A:對照組滑膜組織MMP－9免疫組化染色(400×);圖B:PRP組滑膜組織MMP－9免疫組化染色(400×);圖C:模型組滑膜組織MMP－9免疫組化染色

3 討論

圖3 圖A:各組動物關(guān)節(jié)液中MMP－9濃度，與對照組比較①P＜0.05，與模型組比較②Pp＜0.05;圖B:各組動物血清中MMP－9濃度，與對照組比較③P＜0.05，與模型組比較④P＜0.05

圖4 圖A:各組動物關(guān)節(jié)液與血清中MMP－9濃度成高度正相關(guān)(P＜0.05);圖B:各組動物關(guān)節(jié)軟骨與滑膜組中MMP－9陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)成高度正相關(guān)(P＜0.01)

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis OA)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但有關(guān)軟骨基質(zhì)的降解已得到共識［7］。關(guān)節(jié)軟骨屬于一種無血管、神經(jīng)及淋巴分布的透明軟骨，由軟骨細(xì)胞與軟骨基質(zhì)組成，基質(zhì)主要為蛋白多糖和糖蛋白形成的固相結(jié)構(gòu)，膠原纖維存在其中，構(gòu)成網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，從而賦予關(guān)節(jié)軟骨的力學(xué)特征，基質(zhì)結(jié)構(gòu)特征和含量的任何異常，將導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［8］。目前研究證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎的主要病理學(xué)特征之一是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，而基質(zhì)的降解與基質(zhì)金屬蛋白酶－9(Matrix metalloproteinases－9，MMP－9)有關(guān)。MMP－9對蛋白聚糖有高度的裂解活性，在實(shí)驗(yàn)性O(shè)A的早期，MMP－9可降解Ⅺ型膠原，可能與OA早期膠原網(wǎng)絡(luò)水腫有關(guān)。MMP－9除能直接降解蛋白多糖的核心外，還可激活MMP－1，加速膠原的病理性降解，也使與透明質(zhì)酸相連的可聚蛋白多糖由于網(wǎng)絡(luò)的松解而丟失［9］。MMP－9能夠特異性裂解軟骨基質(zhì)中的膠原分子，破壞軟骨基質(zhì)的膠原網(wǎng)絡(luò)，使軟骨細(xì)胞暴露于炎性因子的攻擊下而出現(xiàn)凋亡，導(dǎo)致軟骨的進(jìn)行性破壞［10］。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)模型組關(guān)節(jié)軟骨的4層結(jié)構(gòu)中，軟骨細(xì)胞均可見到胞漿染成深棕色，陽性細(xì)胞明顯增多，陽性反應(yīng)強(qiáng)烈，顆粒甚至呈深褐色，還可見表層軟骨大量的缺損。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)MMP－9在滑膜組織中也存在高表達(dá)，這與現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎中高表達(dá)MMP－9的結(jié)論是一致的。

PRP含有大量的生長因子，其豐富的生長因子中血小板源性化生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、細(xì)胞表皮生長因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor－β，TGF－β)的含量分別為正常血液的30倍、10倍和7倍。研究發(fā)現(xiàn)PRP中的生物活性生長因子能有效促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，其主要機(jī)制是在骨缺損局部的微環(huán)境中釋放一些生物活性成分［11］。PRP能促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)、促進(jìn)骨折愈合，其機(jī)制可能是與其對干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞具有多向分化潛能的生物學(xué)特性有關(guān)［12］。隨著基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)與臨床研究的發(fā)展，PRP在組織再生工程、軟骨以及軟組織修復(fù)再生等方面有著良好的生物學(xué)效應(yīng)，用其來干預(yù)骨關(guān)節(jié)的病程有著較為理想的前景［13］。MMP－9抑制軟骨糖蛋白的合成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成和基質(zhì)微分子的降解，加重軟骨的損傷。關(guān)節(jié)內(nèi)局部高表達(dá)的MMP－9可能與其影響軟骨細(xì)胞增殖、軟骨損傷的反應(yīng)性和增強(qiáng)關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)有關(guān)［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PRP組機(jī)體內(nèi)MMP－9的含量較模型組顯著降低，軟骨細(xì)胞破壞程度明顯減輕，說明PRP可通過降低機(jī)體內(nèi)MMP－9的含量，而起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。目前OA尚無有效的防治方法，因?yàn)楹苌儆兴幬锬芨淖僌A進(jìn)程。筆者的研究表明PRP能明顯降低MMP－9的含量，可起到保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用。

本實(shí)驗(yàn)在動物模型關(guān)節(jié)腔注射PRP 6周后，PRP組關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織中MMP－9含量較模型組減少，而與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明PRP只能延緩病程進(jìn)展而不能逆轉(zhuǎn)OA的病變進(jìn)程。模型組兔患側(cè)關(guān)節(jié)液中MMP－9含量明顯高于對照組，目前研究表明MMP－9對關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)具有破壞作用，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡增多［15］。筆者的研究結(jié)果與目前的研究是一致的。在本研究中對各組動物關(guān)節(jié)液中的MMP－9濃度進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示對照組關(guān)節(jié)液中MMP－9濃度低于PRP組和模型組，PRP組關(guān)節(jié)液中MMP－9濃度明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本研究進(jìn)一步分析了各組動物血清中MMP－9的濃度，也發(fā)現(xiàn)了類似關(guān)節(jié)液中MMP－9的檢測結(jié)果。且血清和關(guān)節(jié)液中MMP－9含量成高度正相關(guān)，這說明骨關(guān)節(jié)炎不單是一個局部關(guān)節(jié)的病變，在全身血清中都有MMP－9存在，只是病變局部關(guān)節(jié)其濃度明顯增高而已，這或許為以后MMP－9抑制劑治療骨關(guān)節(jié)炎提供了一定的參考理論基礎(chǔ)。