才華，許慧慧，孫娜，宋婷婷，任永晶，楊圣秋

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030)

紫花苜蓿(Medicagosativa)，屬于多年生的豆科植物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、產(chǎn)量高、分布廣，能適應(yīng)多種環(huán)境條件。盡管苜蓿能耐輕微鹽堿，但是高鹽堿地區(qū)苜蓿產(chǎn)量顯著減少[1-2]。如能提高輕度鹽堿地苜蓿的產(chǎn)量，將對(duì)改善鹽堿土及促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

光合作用對(duì)植物的生長(zhǎng)及植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)起著重要的作用，直接影響著農(nóng)作物和牧草的生產(chǎn)力及適應(yīng)性[3]。堿脅迫下光合作用受到抑制較鹽脅迫更為明顯[4-7]，堿脅迫不僅僅會(huì)使植物遭受離子毒害和滲透脅迫，同時(shí)較高水平的pH會(huì)造成植物根圍的營(yíng)養(yǎng)元素離子沉淀，進(jìn)而使它們的可利用性降低，這些離子包括Ca2+、Mg2+、Cl-、 H2PO4-、Fe3+[8-10]，其中Mg2+是構(gòu)成葉綠素的成分。植物除了可以通過(guò)代謝物質(zhì)的合成來(lái)適應(yīng)鹽堿脅迫外，還能通過(guò)改變其自身的代謝途徑提高光合效率而適應(yīng)高鹽分的環(huán)境[11-12]。有些植物如冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)受到干旱或鹽堿脅迫時(shí)，能夠改變它們的光合作用模式，從C3模式轉(zhuǎn)換到景天酸代謝(crassulacean acid metabolism,CAM)[13]。在大多數(shù)耐鹽植物中許多物種都顯示出C4型光合作用[14]。C4植物與C3植物相比有更低光呼吸、較高的光合能力、水分和氮素利用效率以及較高的生物產(chǎn)量，并且更適合在炎熱干燥的環(huán)境下生存[15-16]。在植物中，操縱磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)水平已成改善植物光合效率的一種手段，研究者也嘗試著將C4途徑的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入C3植物，以期通過(guò)提高植物的光合效率來(lái)增強(qiáng)植物的適應(yīng)性[17-19]。Zhang等[20]研究表明在實(shí)際干旱條件下，轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因的水稻株系能夠穩(wěn)產(chǎn)與有較高的光合速率相關(guān)。Qin等[19]研究表明轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因的小麥株系在脅迫期間光合能力提高。因此，光合作用的增強(qiáng)對(duì)于提高植物的耐逆性具有重要的意義。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PPCK)是一個(gè)約31 kDa鈣不依賴的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)類蛋白激酶，能夠使磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)磷酸化[21-22]。PEPC在高等植物多個(gè)代謝過(guò)程中起著非常重要的作用。PEPC有兩種功能形式，即光合型和非光合亞型。PEPC不僅是C4和CAM途徑中催化CO2初級(jí)固定的第一個(gè)酶，而且 PEPC在C3植物的非光合組織中也起著廣泛的作用，包括參與生物合成前體的供應(yīng)，通過(guò)回補(bǔ)C4-二羧酸用于能量及合成代謝，氮同化過(guò)程中對(duì)pH的調(diào)控及信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[23-25]。C4光合作用的酶不僅對(duì)植物正常生長(zhǎng)有著重要的作用，而且在響應(yīng)脅迫方面也是非常重要的[26]。在有毒金屬脅迫時(shí)，根中較高的PEPC活性可以導(dǎo)致有機(jī)酸的合成，如分泌蘋果酸、檸檬酸來(lái)酸化土壤，螯合金屬毒離子[27]。PEPC的活性通過(guò)PPCK的磷酸化催化控制[28]。同時(shí)，多個(gè)研究表明PPCK基因響應(yīng)多種非生物脅迫。在干旱處理下，轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因的水稻株系中的PPCK的酶活及轉(zhuǎn)錄水平(PPCK1、PPCK2)增加，并且PPCK對(duì)C4-PEPC啟動(dòng)子的甲基化及磷酸化催化作用賦予了轉(zhuǎn)基因水稻耐旱性[29]。Monreal等[14]研究表明，鹽和堿脅迫增加了PEPC和PPCK的活性并且增加了PPCK的表達(dá)及蛋白含量。

前期研究發(fā)現(xiàn)，超量表達(dá)野生大豆(Glycinesoja)來(lái)源的GsPPCK1和GsPPCK3基因可有效地提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐堿性[30]。本研究將在此基礎(chǔ)上，從光合作用和有機(jī)酸積累角度探索轉(zhuǎn)GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿耐堿性增強(qiáng)的生理機(jī)制，進(jìn)一步明確GsPPCKs基因在植物耐堿反應(yīng)中的功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料

非轉(zhuǎn)基因?qū)φ正埬?06苜蓿(MedicagosativaLONGMU 806)，黑龍江省農(nóng)科院草業(yè)所購(gòu)買。轉(zhuǎn)GsPPCK1、GsPPCK3基因龍牧806苜蓿由實(shí)驗(yàn)室保存[30]，以龍牧806苜蓿子葉節(jié)為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.2 NaHCO3處理及取材

試驗(yàn)于2016年9月-2017年3月進(jìn)行。每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中定植一個(gè)單株(扦插后30日齡)，營(yíng)養(yǎng)缽的基質(zhì)為蛭石∶草炭土=1∶1。挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行脅迫處理。分成2組，即堿處理組和對(duì)照組。每組每個(gè)株系(包括非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，轉(zhuǎn)GsPPCK1基因株系P1-5、P1-9，轉(zhuǎn)GsPPCK3基因株系P3-1、P3-8)各5個(gè)單株于一托盤中，重復(fù)3次。用200 mmol·L-1NaHCO3進(jìn)行脅迫處理。堿處理組，即每個(gè)托盤一次性加1 L堿脅迫液，每天補(bǔ)加100 mL水于托盤中，pH 值約8.5。對(duì)照組則一次性加1 L 水，每天補(bǔ)加100 mL水于托盤中。

分別在未處理、處理1、3、6、9 d時(shí)，通過(guò)無(wú)損傷的方式進(jìn)行葉綠素含量測(cè)定和光合指標(biāo)測(cè)定。在堿脅迫處理9 d時(shí)，在10:00-14:00，隨機(jī)選取苜蓿葉片，液氮保存，用于有機(jī)酸含量和光合酶活的測(cè)定。堿處理15 d后，觀察植株的表型。

1.3 光合生理指標(biāo)的測(cè)定

采用便攜式葉綠素測(cè)定儀(SPAD-502，廣州滬瑞明儀器有限公司生產(chǎn))，測(cè)定葉綠素相對(duì)含量。同時(shí)，選擇晴朗無(wú)風(fēng)的天氣于上午9:30-11:00(27～30 ℃，光照度8500～10000 lx)，采用光合測(cè)定儀LCi(Li-6400, Li-Cor Inc, USA)測(cè)定轉(zhuǎn)基因苜蓿和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ展?個(gè)株系的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)，每個(gè)葉片重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定10～15個(gè)葉片。

1.4 光合途徑關(guān)鍵酶活性的測(cè)定

1.4.1酶液的制備 取苜蓿葉片10 mg加2 mL研磨緩沖液[1000 μL 50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.5)；200 μL 50 mmol·L-1MgCl2；500 μL 10 mmol·L-1DTT；2% PVP；10%甘油]，用全自動(dòng)樣本快速研磨儀(Tissuelyser-24, 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)充分研磨，于12000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清液定容至2 mL，用于測(cè)定NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-malate dehydrogenase, NADP-MDH)、NADP-蘋果酸酶(NADP-malic enzyme, NADP-ME)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸正磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ribulose1,5 bisphosphate carboxylase, Rubisco)的活性。

1.4.2酶活測(cè)定 PEPC酶活性的測(cè)定參考Sarwat等[31]的方法。參考Johnson等[32]的方法，測(cè)定NADP-MDH酶活性。NADP-ME酶活的測(cè)定參照Sadka等[33]的方法。Rubisco酶活性的測(cè)定參考Gerard等[34]的方法。測(cè)量PPDK的酶活性時(shí)，參考Sayre等[35]的方法。各株系樣品，測(cè)定10個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 有機(jī)酸含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定葉片中有機(jī)酸含量。使用的儀器包括，Agilent 1100 液相色譜儀，G1314紫外檢測(cè)器，G1311A四元泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，迪馬公司色譜柱Diamonsil C18(250.0 mm×4.6 mm, 5 μm)。具體方法如下：配制標(biāo)準(zhǔn)品，將草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸稀釋成1 mg·mL-1，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將上述草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸儲(chǔ)備液按1∶1∶1∶1的體積比混合，并稀釋成所需質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。甲醇-0.01 mol·L-1K2HPO4(3∶97)溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.0。流速為0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫25 ℃，使用前用0.45 μm濾膜過(guò)濾，超聲脫氣。樣品從-80 ℃取出，液氮研磨成粉狀，準(zhǔn)確稱取1 g于離心管中，加入10 mL的超純水，75 ℃水浴提取15 min，使有機(jī)酸充分浸出，冷卻后 10000 r·min-1離心30 min，上清液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用超純水定容。待測(cè)液用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，將濾液置于2 mL 的進(jìn)樣瓶中用于色譜測(cè)定。

1.6 基因表達(dá)差異分析

用含200 mmol·L-1NaHCO3的1/2 Hogland營(yíng)養(yǎng)液，脅迫轉(zhuǎn)基因苜蓿和非轉(zhuǎn)基因苜蓿，按0、1、3、6、12 h取葉片，迅速放入液氮中，存入-80 ℃冰箱保存。采用Real-time-PCR方法測(cè)定堿脅迫處理后基因的表達(dá)變化。根據(jù)蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)對(duì)應(yīng)的基因序列，借助Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)在線工具設(shè)計(jì)引物，序列信息如表1所示。采用比較CT法(ΔΔCT)以GAPDH為內(nèi)參基因，以未經(jīng)處理的樣品作為參照因子。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因均一化處理后，通過(guò)2-ΔΔCT方法計(jì)算；每個(gè)基因作3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，如果有一個(gè)數(shù)值的偏差比較大則取兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)T-test進(jìn)行差異顯著性分析。

相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT=2-(ΔCT處理-ΔCT對(duì)照)=2-[(CT處理-CT內(nèi)參)-(CT對(duì)照-CT內(nèi)參)]

表1 用于基因表達(dá)分析的各基因引物序列信息Table 1 The information of primers for gene expression analysis

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007中標(biāo)準(zhǔn)差、方差分析和T-檢驗(yàn)等函數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析轉(zhuǎn)基因各株系的生理生化指標(biāo)、基因表達(dá)變化與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏牟町?，其中P<0.01表示兩者差異極顯著，0.010.05表示兩者差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因苜蓿堿脅迫后的表型及葉綠素相對(duì)含量的變化

200 mmol·L-1NaHCO3堿脅迫處理15 d后，植株的生長(zhǎng)受到抑制，非轉(zhuǎn)基因植株葉片萎蔫，莖稈干枯，爛根嚴(yán)重，趨于死亡。轉(zhuǎn)基因4個(gè)株系葉片雖也有萎蔫，根系僅部分腐爛，仍能持續(xù)生長(zhǎng)(圖1) ，其中轉(zhuǎn)基因苜蓿P1-5和P3-8兩個(gè)株系較非轉(zhuǎn)基因苜蓿具有較為明顯的耐堿性。葉綠素相對(duì)含量的測(cè)定顯示(圖2)，在正常條件下，轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系葉綠素相對(duì)含量沒(méi)有差異。經(jīng)200 mmol·L-1NaHCO3脅迫處理后，非轉(zhuǎn)基因株系和轉(zhuǎn)基因各株系的葉綠素相對(duì)含量隨脅迫天數(shù)增加均呈下降趨勢(shì)(圖2)。堿脅迫6 d， 所有株系葉綠素含量都有所下降，但P1-5、P3-8株系的葉綠素相對(duì)含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系，達(dá)到極顯著水平。堿脅迫9 d，各株系葉綠素含量降到最低，非轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)葉綠素含量顯著低于P1-5和P3-8，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，略低于P1-9和P3-1(P<0.05)。P1-5，P3-8株系的葉綠素相對(duì)含量與未處理相比變化并不顯著，分別下降了11.27%、13.30%，但非轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量變化極為明顯，下降了39.11%。由此可見(jiàn)，堿脅迫處理后，對(duì)照植株葉綠素含量明顯下降，而轉(zhuǎn)GsPPCK1、GsPPCK3基因苜蓿葉綠素含量的變化并不十分明顯，但轉(zhuǎn)基因各株系耐堿性存在差異。

圖1 轉(zhuǎn)基因苜蓿和非轉(zhuǎn)基因苜蓿在200 mmol·L-1 NaHCO3脅迫處理15 d后的表型 Fig.1 Phenotype of the transgenic alfalfa and non transgenic alfalfa under 200 mmol·L-1 NaHCO3 stress after 15 days LM:非轉(zhuǎn)基因苜蓿龍牧806；P1-5，P1-9：轉(zhuǎn)GsPPCK1基因苜蓿株系；P3-1，P3-8：轉(zhuǎn)GsPPCK3基因苜蓿株系。LM: Non-transgenic alfalfa LONGMU806; P1-5, P1-9: The transgenic samples with GsPPCK1; P3-1, P3-8: The transgenic samples with GsPPCK3.下同The same below.

2.2 堿脅迫下葉片光合參數(shù)的測(cè)定

圖2 200 mmol·L-1 NaHCO3處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿和非轉(zhuǎn)基因苜蓿葉綠素相對(duì)含量的變化Fig.2 Changes in chlorophyll relative content of transgenic alfalfa and non-transgenic alfalfa under 200 mmol·L-1 NaHCO3 treatment 利用T-test進(jìn)行差異顯著性分析，**代表P<0.01 ，*代表0.01

測(cè)定的光合作用參數(shù)顯示，在未經(jīng)脅迫處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因苜蓿和非轉(zhuǎn)基因苜蓿各光合作用參數(shù)并沒(méi)有明顯差異。隨著堿脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，光合參數(shù)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，并且在處理3 d后，各參數(shù)值開始下降(圖3)。從非轉(zhuǎn)基因的植株光合參數(shù)的變化可以看出，在堿脅迫處理初期，各光合指標(biāo)呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明光合作用參與到堿脅迫應(yīng)答反應(yīng)中，并起到積極作用。但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，堿脅迫又嚴(yán)重影響了苜蓿的光合作用，光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)及胞間CO2濃度(Ci)均明顯低于脅迫處理前，非轉(zhuǎn)基因苜蓿各光合參數(shù)下降幅度分別為34.55%、32.50%、33.40%及9.99%。轉(zhuǎn)GsPPCK1、GsPPCK3基因苜蓿各株系的光合作用參數(shù)在堿脅迫3 d后也有所下降，但是較未處理差異不顯著，以上4個(gè)參數(shù)指標(biāo)下降(與未處理相比)的平均值分別為14.65%、15.71%、15.72%及5.90%。由此表明，轉(zhuǎn)基因苜蓿的光合作用受堿脅迫的影響較小。GsPPCK1、GsPPCK3基因的超量表達(dá)緩解了堿脅迫對(duì)光合作用的影響，這一過(guò)程可能與PEPC酶的激活有關(guān)，與葉綠素含量變化的數(shù)據(jù)相一致。

圖3 200 mmol·L-1 NaHCO3處理下轉(zhuǎn)基因苜蓿和非轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)及胞間CO2濃度(Ci)的變化Fig.3 Changes of photosynthetic rate (Pn), transpiration rate (Tr), stomatal conductance (Gs) and intercellular CO2concentration (Ci) of transgenic alfalfa and non-transgenic alfalfa leaves under 200 mmol·L-1 NaHCO3 treatment

2.3 堿脅迫下葉片光合關(guān)鍵酶酶活的變化

測(cè)定了光合關(guān)鍵酶NADP-MDH(NADP-蘋果酸脫氫酶)、NADP-ME(NADP-蘋果酸酶)、PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)、PPDK(丙酮酸正磷酸二激酶)、Rubisco(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶)的酶活(圖4)。堿脅迫處理9 d以上,各光合關(guān)鍵酶酶活性均上調(diào)，但轉(zhuǎn)基因各株系上調(diào)的幅度明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?LM)，并且P1-5和P3-8兩個(gè)株系5個(gè)酶活指標(biāo)與對(duì)照均有極顯著差異(P<0.01)。由此表明，光合途徑中酶活性的提高，在植物對(duì)抗堿脅迫反應(yīng)中起到積極作用[11-12]。另外，在正常情況下，轉(zhuǎn)基因苜蓿P1-5和P3-8株系的NADP-MDH、PEPC、PPDK酶的活性顯著高于對(duì)照(LM)(0.01

2.4 堿脅迫處理后光合途徑中有機(jī)酸含量的變化

按照最佳試驗(yàn)條件對(duì)混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了5種有機(jī)酸基線的分離，各有機(jī)酸回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)為0.9992～1.0000，表明線性關(guān)系良好。幾種有機(jī)酸完全分離，分離效果較好。利用標(biāo)準(zhǔn)品的色譜條件，測(cè)定樣品中各有機(jī)酸的含量(圖5)。

在未處理情況下，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?LM)和轉(zhuǎn)基因各株系4種有機(jī)酸的含量并未存在顯著差異，堿脅迫處理后，4種有機(jī)酸的含量均上升。由此表明，有機(jī)酸含量的上升，是苜蓿自身耐堿的生理響應(yīng)。有機(jī)酸作為pH值調(diào)節(jié)劑，對(duì)于緩解堿脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害起到一定的積極作用。轉(zhuǎn)基因苜蓿4個(gè)株系OAA、PEP、檸檬酸、蘋果酸上升的幅度比較大，較未處理上升2.64、2.43、2.11和1.75倍，而對(duì)照4種有機(jī)酸含量上升的倍數(shù)分別為1.89、2.02、1.76和1.71倍。堿脅迫9 d后，轉(zhuǎn)基因株系P1-5、P3-8的4種有機(jī)酸含量與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾炔町悩O顯著(P<0.01)，而轉(zhuǎn)基因株系P1-9、P3-1與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾炔町愶@著(0.01

圖4 200 mmol·L-1NaHCO3處理9 d后轉(zhuǎn)基因苜蓿和非轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片酶活性的變化Fig.4 Changes of NADP-MDH, NADP-ME, PEPC, PPDK and Rubisco protease activities in leaves of transgenic alfalfa and non-transgenic alfalfa after 200 mmol·L-1 NaHCO3 treatment for 9 days

圖5 200 mmol· L-1NaHCO3處理9 d后轉(zhuǎn)基因苜蓿和非轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片有機(jī)酸含量的變化Fig.5 Changes of oxaloacetic acid (OAA), malic acid, phosphoenolpyruvate (PEP) and citric acid in leaves of transgenic alfalfa and non-transgenic alfalfa after 200 mmol·L-1NaHCO3 treatment for 9 days

2.5 堿脅迫處理后光合途徑相關(guān)基因的表達(dá)變化

測(cè)定光合途徑酶活的同時(shí)，檢測(cè)了光合途徑關(guān)鍵酶對(duì)應(yīng)基因在堿脅迫后表達(dá)的差異(圖6)。堿脅迫處理12 h內(nèi)，5個(gè)基因在轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗抵斜磉_(dá)變化均呈先上升后下降的趨勢(shì)，但在轉(zhuǎn)基因株系P1-5和P3-8中基因表達(dá)的變化顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系。由此表明，在堿脅迫處理后，參與光合作用的相關(guān)基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，響應(yīng)堿脅迫。結(jié)合酶活性和酶反應(yīng)的產(chǎn)物有機(jī)酸含量看，這些基因的差異表達(dá)對(duì)于響應(yīng)堿脅迫起到積極的作用。GsPPCK1和GsPPCK3基因的超量表達(dá)，能夠更有效地啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因苜蓿堿脅迫應(yīng)答反應(yīng)，從而提高光合途徑中相應(yīng)酶的活性，對(duì)轉(zhuǎn)基因苜蓿應(yīng)答堿脅迫起到正向調(diào)控作用。

圖6 200 mmol·L-1 NaHCO3處理12 h內(nèi)轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系葉中PEPC、NADP-MDH、NADP-ME、PPDK和Rubisco基因表達(dá)差異Fig.6 Differences in expression of PEPC, NADP-MDH, NADP-ME, PPDK and Rubisco genes in transgenic and non-transgenic lines during 12 h with 200 mmol·L-1 NaHCO3 treatment

3 討論

C3植物的C3循環(huán)是在單細(xì)胞中完成的，大氣中的CO2直接通過(guò)Rubisco催化的羧化反應(yīng)進(jìn)入Calvin循環(huán)，而C4循環(huán)是在葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞中協(xié)同完成。由于PEPC對(duì)其底物CO2有較高的親和力，所以C4植物固定CO2的能力遠(yuǎn)大于C3植物。基于C4植物光合作用的高效性及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，已有大量研究試圖將C4植物光合作用關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化C3植物，以期在C3中建立起一個(gè)類似于C4循環(huán)的光合途徑，以提高光合效率[36]并增強(qiáng)抗逆能力[18-19]。Suzuki等[37]將來(lái)源于C4植物類黍尾稃草(Urochloapanicoides)的PEPCK基因轉(zhuǎn)化水稻，水稻葉綠素含量增加，通過(guò)碳同位素標(biāo)記顯示植物細(xì)胞質(zhì)中PEP含量增加，并形成PEP流從轉(zhuǎn)化植株的葉綠體中運(yùn)出。但是轉(zhuǎn)基因水稻的光合效率并未發(fā)生改變，這可能由于導(dǎo)入的PEPCK不能與水稻內(nèi)源PEPC協(xié)同作用以形成有效的C4循環(huán)所致[37]。本研究將C3植物野生大豆來(lái)源的PPCK1和PPCK3基因轉(zhuǎn)入苜蓿，在堿脅迫下，轉(zhuǎn)基因苜蓿葉綠素含量明顯高于對(duì)照，光合效率相關(guān)參數(shù)證明轉(zhuǎn)基因苜蓿的光合效率明顯高于對(duì)照。測(cè)定了碳同化過(guò)程中的關(guān)鍵酶活性也都明顯高于對(duì)照，并且PEPC、NADP-MDH、NADP-ME、PPDK和Rubisco基因表達(dá)變化也有較對(duì)照明顯的變化。這些研究結(jié)果表明，C3植物野生大豆來(lái)源的GsPPCK1和GsPPCK3可與苜蓿PEPC協(xié)同作用，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因苜蓿的光合效率，從而緩解堿脅迫對(duì)苜蓿的損傷。

植物在遭受堿脅迫時(shí)，本身可以通過(guò)有機(jī)酸積累來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)pH，這是植物調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境適應(yīng)堿脅迫的一種特殊方式[38]。楊國(guó)會(huì)[39]報(bào)道小冰麥可能通過(guò)積累有機(jī)酸來(lái)彌補(bǔ)負(fù)電荷不足，以保持細(xì)胞內(nèi)pH穩(wěn)定。郭立泉等[40]模擬0～200 mmol·L-1的鹽脅迫和堿脅迫條件處理星星草(Puccinelliatenuiflora)幼苗，發(fā)現(xiàn)星星草體內(nèi)大量積累以檸檬酸為主的有機(jī)酸是抗鹽堿植物星星草對(duì)堿脅迫的關(guān)鍵生理響應(yīng)。楊春武等[41]模擬不同強(qiáng)度的鹽、堿脅迫條件，對(duì)小冰麥苗進(jìn)行12 d脅迫處理，測(cè)定莖葉組織液的pH和有機(jī)酸等溶質(zhì)的濃度，結(jié)果表明，有機(jī)酸積累是小冰麥在堿脅迫下保持體內(nèi)離子平衡和pH穩(wěn)定的關(guān)鍵生理響應(yīng)。PEPC除了固定CO2，還可以在通過(guò)羧化的同時(shí)減少細(xì)胞中HCO3-的含量，從而平衡pH值。另外，在碳固定的循環(huán)中，有機(jī)酸的產(chǎn)生也會(huì)緩解細(xì)胞質(zhì)中的pH值。研究中也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)GsPPCK1/GsPPCK3基因紫花苜蓿葉片的有機(jī)酸含量，包括草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸的含量相對(duì)于對(duì)照株系都顯著增加。

4 結(jié)論

GsPPCK1和GsPPCK3基因在苜蓿中的超量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因苜蓿的光合作用受堿脅迫的抑制較??；在光合碳固定的過(guò)程中有機(jī)酸含量的增加對(duì)緩解高pH起到促進(jìn)作用。光合效率的增強(qiáng)、有機(jī)酸積累的協(xié)同作用是轉(zhuǎn)GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿耐堿性增強(qiáng)的主要原因。