安飛宇，武俊瑞，解夢汐，姜靜，邱博書，唐筱揚，烏日娜

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

豆醬又名黃豆醬、黃醬或大豆醬，是以大豆為主要原料制得而成，經(jīng)自然發(fā)酵而成的半流動狀態(tài)的發(fā)酵食品，在我國北方地區(qū)稱為大醬[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬作為日常的調(diào)味品，因其獨特的風(fēng)味在中國、日本[2]、韓國[3]都深受人們的喜愛。豆醬中富含大豆蛋白質(zhì)、蛋白黑素、肽類、異黃酮和維生素等[4]。最近，豆醬引起人們廣泛的關(guān)注，不僅是因為其豐富的營養(yǎng)價值，還因為豆醬具有抗氧化性[5]、抑制血清膽固醇上升、降血壓[6]、抗誘變性[7]和抗癌[8]等保健功能。

傳統(tǒng)的豆醬制作工藝分為兩個階段，分別為制塊階段及制醬階段。制塊階段較為重要，醬塊可以給豆醬提供豐富的細(xì)菌及真菌，進(jìn)而使其產(chǎn)生獨特的風(fēng)味。近年來，工廠通過純種發(fā)酵的方法生產(chǎn)豆醬，縮短了生產(chǎn)周期并保持產(chǎn)品穩(wěn)定性。然而工業(yè)化豆醬菌種單一，使豆醬的醬香、風(fēng)味和適口性遠(yuǎn)不及傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬[9]。因此，研究傳統(tǒng)發(fā)酵醬塊中的微生物多樣性至關(guān)重要。2010年Lee等應(yīng)用DGGE技術(shù)研究了韓國醬塊微生物群落，發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌（Bacillus）和耐久腸球菌（Enterococcus durans）為主要細(xì)菌；犁頭霉(Absidia)、曲霉（Aspergillus）和假絲酵母（Candida）為主要真菌[10]。2014年孫雯等應(yīng)用純培養(yǎng)的方法鑒定出豆醬中的霉菌有米曲霉(Aspergillus oryzae)、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)、犁頭霉屬(Absidia)、大毛霉組(Mucedo)及曲霉屬(Aspergillus)[11]。目前國內(nèi)外對豆醬的微生物多樣性、加工工藝等做了大量研究，但對于東北傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬醬塊的研究涉及甚少且主要集中于對其真菌的研究[3,10]。

近年來測序技術(shù)不斷的進(jìn)步，越來越多的研究者利用新一代測序技術(shù)對發(fā)酵食品微生物進(jìn)行分析。2014年焦晶凱等采用第二代測序 Illumina MiSeq方法，全面的展現(xiàn)了內(nèi)蒙古四個不同地區(qū)的自然成熟干酪中的細(xì)菌微生物多樣性[12]。2016年陳澤斌等首次應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析玉米內(nèi)生細(xì)菌多樣性，全面而準(zhǔn)確地分析了玉米內(nèi)生細(xì)菌的種類組成[13]。本試驗采用高通量測序技術(shù)分析了傳統(tǒng)醬塊發(fā)酵過程中真菌和細(xì)菌的群落演替，揭示傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬微生物群落特征，為提高豆醬品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的制作工藝及采集

樣品采自開原傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬醬塊。春季制醬塊，采用傳統(tǒng)工藝室溫發(fā)酵，具體生產(chǎn)工藝為：取新鮮的大豆，去掉雜質(zhì)后浸泡12 h，蒸煮3~5 h，直至大豆變軟，攪碎后制成長方形醬塊，自然發(fā)酵2個月后制成成熟醬塊。從制成醬塊起，每隔20 d采集一次樣品，樣品編號分別為KY 0 d、KY 20 d、KY 40 d、KY 60 d。取樣后置于冰盒中，并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保藏。

1.2 主要試劑與儀器

基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），PCR引物由金唯智公司設(shè)計，Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen,Carlsbad, CA)，Qubit2.0 Fluorometer (Invitrogen,Carlsbad, CA)，MetaVx?文庫構(gòu)建試劑盒(GENEWIZ,Inc., South Plainfield, NJ, USA)，Illumina MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)，Agilent 2100 生物分析儀(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)等。

1.3 樣品總DNA的提取

按照參考文獻(xiàn)[14]的方法提取醬塊的總 DNA，使用Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA)檢測DNA樣品的濃度。瓊脂凝膠電泳檢測DNA的完整性。所提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增及測序

以 50 ng DNA 為模板，用上游引物（CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT）和下游引物(GGACTACNVGGGTWTCTAATCC)擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA基因的 V3和 V4區(qū)，同時使用上游引物（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）和下游引物（CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V4和V5區(qū)。并在其PCR產(chǎn)物的末端加上含有Index的接頭。

以 50 ng DNA為模板。使用上游引物（ACCTGCGGARGGAT）和下游引物（GAGATCCRTTGYTRAA）擴(kuò)增真菌的ITS1區(qū)，用上游引物（GTGAATCATCGARTC）和下游引物（TCCTCCGCTTATTGAT）擴(kuò)增真菌的ITS2區(qū)。并在其PCR產(chǎn)物末端加上含有Index的接頭。

采用Agilent 2100生物分析儀對文庫質(zhì)量進(jìn)行檢測，并且通過Qubit和實時定量PCR檢測文庫濃度。DNA文庫混合后進(jìn)行雙端測序(PE)，通過MiSeq工具中的MiSeq Control Software (MCS)進(jìn)行圖像分析和堿基識別。

1.5 數(shù)據(jù)分析

在Illumina basespace云端計算平臺進(jìn)行初始分類分析[14]，以16S rDNA序列97%相似度作為分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)的劃分標(biāo)準(zhǔn)。使用QIIME平臺計算Chao1多樣性指數(shù)。對樣品中物種多樣性信息進(jìn)行分析，使用 Ribosomal Database Project (RDP) classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個水平統(tǒng)計每個樣本的群落組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品復(fù)雜度分析

樣品的復(fù)雜度即Alpha多樣性反映微生物的多樣性和群落的物種豐富度，包括可操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)等（如表1）。醬塊發(fā)酵不同階段共得到細(xì)菌的有效序列數(shù)為365,765條，平均為91,441條；醬塊發(fā)酵不同階段共得到真菌的有效序列數(shù)為251,053條，平均為62,763條。樣品OTU及Chao1指數(shù)可反映微生物群落的物種豐富度，醬塊發(fā)酵 0 d時細(xì)菌和真菌的OTUs數(shù)分別為38和40，此時OTUs數(shù)最高，說明此時物種最為豐富。醬塊發(fā)酵20 d時細(xì)菌OTUs數(shù)為19，40 d時細(xì)菌OTUs數(shù)為16，60 d時細(xì)菌OTUs數(shù)為26，可以看出細(xì)菌物種豐富度先降低再升高。醬塊的各個發(fā)酵階段真菌的OTUs數(shù)總體變化不太明顯。但除發(fā)酵0 d外，真菌的OTUs數(shù)明顯高于細(xì)菌。說明就各個發(fā)酵階段而言，真菌均為優(yōu)勢菌群。

群落生態(tài)學(xué)可通過樣品的Shannon指數(shù)來反應(yīng)微生物群落的多樣性，就醬塊中的細(xì)菌而言，發(fā)酵 0 d時多樣性最高，后同其物種豐度的變化趨勢一致，呈先降低后升高趨勢。就真菌而言，其多樣性呈先升高后降低趨勢。兩種截然相反的變化趨勢表明，醬塊發(fā)酵過程中的細(xì)菌和真菌可能存在一些相互作用。此前，雖有學(xué)者研究表明發(fā)酵食品中細(xì)菌真菌存在相互作用[15~17]，但所研究大多為單一菌種之間的互作，且鮮有有關(guān)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中菌群間相互作用的報道。同時值得一提的是，60 d時細(xì)菌OTUs數(shù)僅為26，但其多樣性指數(shù)卻是所有樣品中最高的，說明發(fā)酵末期醬塊中細(xì)菌分布的均勻度較高。此外，所有樣品Coverage值均接近于 1，表明覆蓋率較高，測序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實情況。

表1 Alpha多樣性Table 1 Alpha diversity

2.2 稀釋性曲線

圖1 醬塊發(fā)酵不同階段的稀疏曲線Fig.1 Parefaction analysic of meju in different fermentation stages

采用對序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與其所能代表OTUs的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線。如圖1所示，圖a為醬塊細(xì)菌稀釋性曲線，圖b為醬塊真菌稀釋性曲線。在<5000條序列時，所測得的OTUs數(shù)量隨測序深度的增加而迅速增加；在>5000條序列時，所測得的OTUs數(shù)目增長速度減慢，最終趨于平臺期，說明測序深度合理，能夠較為全面地反應(yīng)醬塊各發(fā)酵時期微生物多樣性變化情況。

2.3 發(fā)酵不同階段門級水平菌群結(jié)構(gòu)分析

圖2 門級水平下醬塊樣品微生物群落變化Fig.2 Microbial community changes in meju samples at the phylum level

對樣品中物種多樣性信息進(jìn)行分析，比對數(shù)據(jù)庫可知，醬塊發(fā)酵不同階段的細(xì)菌主要分四大門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。由圖2a可知，醬塊發(fā)酵不同階段的優(yōu)勢細(xì)菌均為厚壁菌門（Firmicutes）(占總數(shù)93.02%~99.51%)，其次為變形菌門（Proteobacteria）。

不同發(fā)酵時期醬塊的真菌組成主要分三大門，分別為接合菌門（Zygomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota），且不同發(fā)酵階段優(yōu)勢菌門不同。由圖2b可知，在醬塊發(fā)酵0 d時優(yōu)勢真菌為其他（46.16%），醬塊發(fā)酵20 d和40 d時優(yōu)勢真菌為接合菌門（占總數(shù)59.95%和61.03%），醬塊發(fā)酵60 d時優(yōu)勢真菌為子囊菌門（占總數(shù)53.85%）。由此可知，相對于細(xì)菌而言，醬塊發(fā)酵期間真菌群落變化較大，占主導(dǎo)作用。

2.4 醬塊發(fā)酵不同階段屬級水平菌群結(jié)構(gòu)分析

圖3 屬級水平下醬塊樣品微生物群落變化Fig.3 Microbial community changes in meju samples at the genus level

通過對醬塊發(fā)酵不同階段樣品進(jìn)行檢測，動態(tài)跟蹤了整個醬塊發(fā)酵過程中細(xì)菌群落變化。在屬水平共檢測出細(xì)菌40個細(xì)菌群落，主要為厚壁菌門中的乳桿菌、魏斯氏菌、腸球菌和明串珠菌等。群落組成如圖3a所示。

醬塊發(fā)酵初期，魏斯氏菌為優(yōu)勢細(xì)菌類群達(dá)到66.5%。這一結(jié)果與陳浩等人的研究結(jié)果相似[18]。其次的優(yōu)勢細(xì)菌類群為乳桿菌(占總數(shù)19.31%)，明串珠菌(占總數(shù) 6.26%)為主要細(xì)菌類群。此外，梭菌(Clostridium)、乳球菌(Lactococcus)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)、鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)、不動桿菌（Acinetobacter）和腸桿菌（Enterobacter）僅在此階段（0 d）被檢測出，有可能是豆醬醬塊在制作過程中，人員、器具或豆子上沾染了雜菌，同時剛制好的醬塊濕度高，有助于某些細(xì)菌生長，但隨著發(fā)酵醬塊逐漸風(fēng)干以及微生物之間相互作用，這些細(xì)菌的數(shù)目會逐漸減少。

醬塊發(fā)酵中期（20 d和40 d），乳桿菌的數(shù)目逐漸增加，最高可達(dá)76.12%，成為優(yōu)勢細(xì)菌，其次為魏斯氏菌、腸球菌和明串珠菌。腸球菌在發(fā)酵0 d和20 d時僅占1.81%和0.11%，在40 d時增長到48.34%，末期60 d降到17.68%。2015年田甜應(yīng)用高通量測序法檢測出中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中腸球菌屬和四聯(lián)球菌屬為主要菌種[19]。說明腸球菌不僅在醬塊發(fā)酵期間起到一定作用，其作用也可以延續(xù)至液態(tài)豆醬發(fā)酵階段。此外，2009年，Kim等應(yīng)用DGGE的方法檢測出韓國豆醬的主要細(xì)菌為明串珠菌、腸球菌和四聯(lián)球菌[20]。由此可見，腸球菌不僅在中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中起重要作用，在韓國豆醬中也廣泛存在，同時也說明有潛在致病菌存在于傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬醬塊中，有必要使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測。

醬塊發(fā)酵末期 60 d時，乳桿菌(占總數(shù) 64.26%)仍為優(yōu)勢細(xì)菌，其次為腸球菌(占總數(shù)17.68%)和魏斯氏菌(占總數(shù)8.13%)。由此可見，乳桿菌為醬塊發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌種(占總數(shù)50.03%和76.12%)，在本研究中，乳桿菌在0 d時含量較低，隨著發(fā)酵迅速增長后有所減低，最后增長到64.26%，說明乳桿菌在醬塊發(fā)酵中起到重要作用。并且本研究中乳桿菌主要為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（占總數(shù)2.93%~63.14%）。植物乳桿菌是一種食品及藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)可使用的乳桿菌，在醬油、豆醬中廣泛存在[21]，在酶的作用下，可以將精氨酸、組氨酸、天門冬氨酸等氨基酸分解代謝轉(zhuǎn)化成雜醇，對豆醬風(fēng)味形成起到重要作用。2011年趙建新利用 PCR-DGGE技術(shù)在自然發(fā)酵豆醬中鑒定出植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌等[22]。因此，我們認(rèn)為醬塊的發(fā)酵對最終成品醬的風(fēng)味有著一定的影響，其中的乳桿菌起到了重要作用。

此外，一些含量較少但種類較多的微生物及未鑒定出的微生物都被歸類為Other，在0 d時為5.55%，中期降到1.33%和0.49%，在末期升到8.33%。這些含量相對較低的微生物可能對維持微生物環(huán)境穩(wěn)定起重要作用，同時也有潛力在適合的環(huán)境下變?yōu)閮?yōu)勢菌群。因此說明影響醬塊發(fā)酵的微生物群落中不僅包括上述相對含量較多的優(yōu)勢微生物，也還包含許多不能忽視的稀少微生物。

醬塊發(fā)酵不同階段共檢測出真菌21種。主要為接合菌門中的毛霉菌（Mucor）和根霉菌(Rhizopus)以及子囊菌門中的青霉菌(Penicillium)、鏈格孢屬(Alternaria)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、單端孢屬（Trichothecium）等。如圖3b所示，醬塊發(fā)酵初期0 d時，Other（占總數(shù)46.27%）為優(yōu)勢真菌，其次為毛霉菌(占總數(shù)18.16%)、青霉菌(占總數(shù)15.95%)和根霉菌（占總數(shù)15.31%）。此時真菌種類較為豐富，另外根霉菌僅在此時被檢測出。相似的結(jié)果已有報道，如陳嶸等人在我國多個地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中均分離出根霉菌，但大多分離自發(fā)酵初期的醬醅樣品，且生長并不旺盛，不能在整個醬醅發(fā)酵過程中占據(jù)優(yōu)勢[23]。因此可以認(rèn)為，根霉菌可能僅在醬塊發(fā)酵初期起到一定作用，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其作用逐漸減小。同時，雖然根霉菌可以產(chǎn)出乳酸、蛋白酶和蘋果酸等物質(zhì)，并已廣泛應(yīng)用于腐乳、醬油等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中[24~26]，但尚未有應(yīng)用到我國工業(yè)生產(chǎn)豆醬中的相關(guān)報道。

醬塊發(fā)酵中期 20~40 d時，毛霉菌(占總數(shù)59.94%~61.03%)數(shù)目迅速升高并保持穩(wěn)定，成為優(yōu)勢真菌。20 d時除優(yōu)勢菌屬毛霉菌外，其它主要菌屬依次為德巴利氏酵母(占總數(shù) 24.14%)和青霉菌(占總數(shù)14.41%)。醬塊發(fā)酵40 d時，毛霉菌(占總數(shù)61.03%)仍為優(yōu)勢真菌，其次為青霉菌(占總數(shù)27.84%)和單端孢屬（占總數(shù)9.86%）。醬塊發(fā)酵末期60 d時，毛霉菌(占總數(shù)46.11%)仍為優(yōu)勢真菌，其次為鏈格孢屬(占總數(shù) 36.14%)和青霉菌(占總數(shù) 15.26%)。可以看出，毛霉菌在整個醬塊發(fā)酵過程中均大量存在，毛霉菌為濕性真菌，醬塊的環(huán)境有利于毛霉菌的生長。毛霉可以分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等復(fù)雜酶系，這些蛋白酶降解蛋白質(zhì)大分子形成多肽或氨基酸，并協(xié)同細(xì)菌、酵母的發(fā)酵作用，生成一些有機(jī)酸、酯類等物質(zhì)。同時，毛霉菌也是腐乳發(fā)酵的主要菌種，其對大豆蛋白有較高的水解率[27~29]。但也有報道稱毛霉菌僅在醬塊發(fā)酵初期為優(yōu)勢菌屬，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，曲霉菌含量不斷升高并在發(fā)酵中后期逐漸成為優(yōu)勢菌屬[30]。此外，本試驗中發(fā)酵末期被大量檢出的鏈格孢屬(36.14%)在其他文獻(xiàn)中鮮有報道，鑒于傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬醬塊中微生物群落變化研究報道較少的現(xiàn)狀，本試驗結(jié)果與以往研究存在差異，因此我們認(rèn)為傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬醬塊中微生物群落組成與原料組成，取樣時間，所在區(qū)域，制作方法均有密切聯(lián)系，還需要進(jìn)行后續(xù)試驗及數(shù)據(jù)積累，以期進(jìn)一步了解醬塊發(fā)酵過程中微生物組成差異的原因。

3 結(jié)論

3.1 本試驗首次應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析傳統(tǒng)發(fā)酵醬塊不同階段的細(xì)菌及真菌的群落結(jié)構(gòu)，揭示了傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬醬塊在0 d、20 d、40 d、60 d四個發(fā)酵階段中細(xì)菌及真菌的群落組成。在門級水平上共檢測出細(xì)菌四個類群，其中厚壁菌門為優(yōu)勢細(xì)菌；檢測出真菌三個類群，其中接合菌門和子囊菌門為優(yōu)勢真菌。在屬水平上共檢測出40個細(xì)菌分類群，其中乳桿菌、魏斯氏菌和腸球菌為優(yōu)勢細(xì)菌。乳桿菌、魏斯氏菌、腸球菌、明串珠菌和葡萄球菌在各階段均被檢測出。共檢測出21個真菌分類群，其中毛霉菌、青霉菌、德巴利氏酵母屬和根霉菌為主要真菌。毛霉菌、青霉菌、德巴利氏酵母屬、根霉菌假絲酵母、鏈格孢屬、根霉菌和鐮刀菌屬在發(fā)酵各階段均被檢測出。

3.2 近年來，工業(yè)生產(chǎn)制作醬塊通常添加黑曲霉或米曲霉，但單一的菌種使發(fā)酵豆醬的風(fēng)味遠(yuǎn)不及傳統(tǒng)自然發(fā)酵所制作出來的豆醬。本研究發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵醬塊中細(xì)菌資源十分豐富，可以將有益細(xì)菌如乳桿菌、魏斯氏菌、明串珠菌等混合添加到醬塊中發(fā)酵，提高商業(yè)豆醬的風(fēng)味及品質(zhì)。此外，還需結(jié)合代謝組學(xué)，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)等其他技術(shù)，更加全面地分析醬塊發(fā)酵過程中微生物的相互作用及其作用機(jī)制，從而指導(dǎo)生產(chǎn)。