杜永靜，陳葉福，李潔，何亞輝，龔瑞，郭學(xué)武，肖冬光

（天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

白酒是我國(guó)特有的蒸餾酒，在人們的日常生活中占有重要地位，酯類作為白酒中含量最多的香味成分之一，種類較多，是白酒香氣的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)白酒的風(fēng)味和香型起著關(guān)鍵性作用。適量的酯可使酒體豐滿，香味協(xié)調(diào)，給飲酒者帶來喜悅感。白酒中酯類主要分為兩大類，乙酸酯類和脂肪酸乙基酯類。乙酸酯類主要包括：乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸異丁酯等，在各種香型白酒中含量均較高，對(duì)白酒風(fēng)味貢獻(xiàn)比較大，其中乙酸乙酯是清香型、芝麻香型等多種香型白酒的主體香；乙基酯主要有丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等[1]。我國(guó)名優(yōu)白酒中以含乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯四大酯為主，其和占總酯含量的80%以上，含量多少與白酒香型相關(guān)[2]。

以己酸乙酯為主體香成分的濃香型白酒，是我國(guó)產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的白酒。己酸乙酯是濃香型白酒的主體香，然而釀酒酵母自身雖然具有極強(qiáng)的酒精發(fā)酵效率，但其產(chǎn)酯能力極低。在酵母發(fā)酵過程中，代謝產(chǎn)物己酸乙酯含量很少，一般在0.5 μg/mL左右。能否讓釀酒酵母大量合成和分泌己酸乙酯，是一個(gè)長(zhǎng)期困擾我國(guó)白酒界的問題[3]。

影響白酒釀造最終產(chǎn)己酸乙酯的因素很多，如酵母菌種，原料、糖化劑及發(fā)酵工藝等[4,5]。白酒中己酸乙酯等中鏈脂肪酸乙基酯主要是在酒精發(fā)酵后期，由大曲和窖泥中酯化能力極強(qiáng)的霉菌（根霉、毛霉和曲霉）在酯化酶的作用下酯化己酸和酵母產(chǎn)生的乙醇合成，但其發(fā)酵周期長(zhǎng)，糧耗大[6]。工業(yè)上為了提高白酒的酯含量，通常采用的方法有：添加生香酵母、延長(zhǎng)發(fā)酵期和窖藏時(shí)間[7]。然而這些方法在提高酯產(chǎn)量的同時(shí)，增加了人力和物力的消耗，延長(zhǎng)發(fā)酵期還帶來了糠嗅味、澀味、酸味等異味，會(huì)降低白酒品質(zhì)[8]。為提高釀酒酵母產(chǎn)己酸乙酯的能力，使得釀酒酵母在主發(fā)酵期，保持其高產(chǎn)乙醇特性的同時(shí)高產(chǎn)己酸乙酯，以達(dá)到縮短白酒發(fā)酵周期、減少糧耗的目的，故有必要構(gòu)建高產(chǎn)己酸乙酯的釀酒酵母菌株。因此，研究和構(gòu)建高產(chǎn)己酸乙酯釀酒酵母用于白酒生產(chǎn)，對(duì)于改善白酒風(fēng)味和品質(zhì)具有重要意義[9,10]。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的α5F-FAS1及α5O-FAS1作為出發(fā)菌株[11]，過表達(dá)FAS2基因，從而獲得FAS1，F(xiàn)AS2共同過表達(dá)的菌株α5F-FAS1,2和α5O-FAS1,2，研究共表達(dá)FAS基因?qū)χ墟溨舅嵋阴ギa(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY15的單倍體α5均為天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。其中質(zhì)粒Yep352-P為本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pUC6由德國(guó)Hegemann教授惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

YEPD培養(yǎng)基（m/V）：葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨2%。

LB培養(yǎng)基（m/V）：葡萄糖1%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%。

以上兩種培養(yǎng)基，自然pH值，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米糖化醪。

1.1.3 試劑和酶

限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、rTaq聚合酶、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR純化試劑盒及熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；卡納霉素（KanMX）購(gòu)自Merck公司；酵母基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物由金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.4 儀器

PCT-200型PCR基因擴(kuò)增儀，臺(tái)式高速離心機(jī)，電熱恒溫水浴鍋電子天平，DYY-4c型電泳儀，Reference-2型移液槍，DL102x型電熱鼓風(fēng)干燥箱，AgilentGC 7890，StepOnePlus?實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)采用同源重組基因改造的方法，同時(shí)結(jié)合質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)將相應(yīng)基因連接到載體Yep352-P上，然后以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Hxt16基因?yàn)檎衔稽c(diǎn)，過表達(dá)脂肪酸合成酶亞基FAS2基因，并篩選得到重組菌株。

1.2.1 引物

本實(shí)驗(yàn)所用到的PCR反應(yīng)引物見表1，引物設(shè)計(jì)均采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)。具體引物說明如下：根據(jù)NCBI公布的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的FAS2基因，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 FAS2基因的引物對(duì)FAS2-U/FAS2-D。根據(jù)pUC6質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增KanMX抗性基因序列的引物KAN-U和KAN-D。根據(jù)NCBI公布S. cerevisiaeS288c的Hxt16基因序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 HXT16上游同源臂序列FA的引物對(duì)FA-U(Hxt16)/FA-D(Hxt16)，及 HXT16下游同源臂序列 FB的引物對(duì) FB-U(Hxt16)/FB-D(Hxt16)。根據(jù)Yep352-P質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增過表達(dá)片段的引物對(duì)PGK1P-U/PGK1T-D。

1.2.2 重組質(zhì)粒Yep-PF2質(zhì)粒構(gòu)建

將純化過的 FAS2片段用 Xho1酶切連入Yep352-P，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒Yep-PF2。構(gòu)建過程詳見圖1。

圖1 質(zhì)粒Yep-PF2的構(gòu)建Fig.1 Flow chart of recombinant plasmid Yep-PF2 construction

表1 PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.2.3 酵母轉(zhuǎn)化

從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）α5的基因組上擴(kuò)增得到上下同源臂FA和FB，從質(zhì)粒Yep-PF2上擴(kuò)增得PGK1p-FAS2-PGK1T片段，從質(zhì)粒pug6上擴(kuò)增得loxp-KANMX-loxp片段，使用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[12]轉(zhuǎn)化到釀酒酵母α5中，涂布含 1000 μg/mL G418 YEPD平板，30 ℃，靜置培養(yǎng)48 h，對(duì)YEPD平板上生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行篩選驗(yàn)證。

1.2.4 發(fā)酵驗(yàn)證

從YEPD斜面上挑取1環(huán)菌種接入含5 mL一級(jí)種子培養(yǎng)基的試管中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，進(jìn)入穩(wěn)定期后，按照10%的接種量將其接種到含45 mL二級(jí)種子培養(yǎng)基的三角瓶中。

30 ℃靜置培養(yǎng)16～17 h至對(duì)數(shù)期的后期，然后按照10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。30 ℃靜置發(fā)酵，每隔12 h稱重1次，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定CO2累計(jì)失重、發(fā)酵時(shí)間、酒精度、發(fā)酵液殘余還原糖及酯的含量，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，取平均值。

1.3 分析方法

1.3.1 CO2失重的測(cè)定

在發(fā)酵過程中，按照文獻(xiàn)[13]描述的方法每隔12 h稱重1次。

1.3.2 還原糖的測(cè)定?

斐林試劑法[13]。

1.3.3 酒精度的測(cè)定

酒精計(jì)比重法[13]。

1.3.4 酯測(cè)定方法

1.3.4.1 乙酸乙酯測(cè)定方法[14]

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，得到含乙酸乙酯的樣品進(jìn)行氣相色譜分析。根據(jù)Agilent GC7890氣相色譜說明書及有關(guān)白酒樣品檢測(cè)資料設(shè)定檢測(cè)高級(jí)醇的最佳條件為：色譜柱：105 m×0.530 mm毛細(xì)管柱；柱溫50 ℃保持8 min，然后以5 ℃/min的速度升溫至150 ℃，再保持15 min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測(cè)器溫度 200 ℃；載氣流速 20 mL/min；氫氣流速 30 mL/min；空氣流速400 mL/min；尾吹速度25 mL/min；分流比 10∶1；進(jìn)樣量 1 μL。

1.3.4.2 中鏈脂肪酸乙酯測(cè)定方法[11,15]

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，得到含中鏈脂肪酸乙酯的樣品進(jìn)行氣相色譜和氣質(zhì)色譜（GC-MS）分析。將酒樣稀釋至12%(V/V)，取8 mL置于20 mL螺口頂空樣品瓶，加3 g氯化鈉，放入磁性轉(zhuǎn)子，用聚四氟乙烯將瓶口緊密封好。樣品在恒溫磁力攪拌器中60 ℃平衡 10 min，將萃取頭插入瓶?jī)?nèi)頂空吸附 40 min。萃取后將萃取頭插入GC-MS系統(tǒng)進(jìn)樣口，250 ℃解吸附5 min。

1.3.4.3 氣相色譜條件

色譜柱為 Agilent CP-Wax（60 m×0.25 mm×0.5 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流；載氣氦氣流速為0.8 mL/min；升溫程序?yàn)槠鹗?0 ℃維持2 min，按照2 ℃/min的速度升到100 ℃，再按照4 ℃/min的速度升到230 ℃，維持3 min。質(zhì)譜條件：EI；70 eV；掃描范圍30～500 u；離子源溫度230 ℃。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，并使用 SPSS 11.0和EXCEL 2013軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變株的構(gòu)建與驗(yàn)證

2.1.1 重組質(zhì)粒Yep-PF2構(gòu)建與驗(yàn)證

圖2 重組質(zhì)粒Yep-PF2的驗(yàn)證Fig.2 The verification of recombinant plasmid of Yep-PF2

使用1.2的方法，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒Yep-PF2。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖 2所示。其中 1道為Yep-PF2用XhoI酶切后的線性化片段，分別存在大小為6958 bp和5664 bp的條帶；2道為以a5基因組為模板擴(kuò)增得到的FAS2基因片段，大小為5664 bp；3道為Yep-P用XhoI酶切后的線性化質(zhì)粒，大小為6958 bp。酶切結(jié)果與理論預(yù)期相符，說明FAS2基因片段成功插入到Y(jié)ep-P上的PGK1啟動(dòng)子和終止子中間的多克隆位點(diǎn)處，Yep-PF2質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.1.2 過表達(dá)FAS2基因突變株的構(gòu)建與驗(yàn)證

圖3 重組片段的同源重組示意圖Fig.3 The process of homologous recombination

用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將四個(gè)片段：上同源臂FA、下同源臂 FB、PGK1p+FAS2+PGK1T片段、loxP-KanMX-loxP基因片段導(dǎo)入釀酒酵母α5F-FAS1及α5O-FAS1。通過FA和FB片段與酵母基因組上HXT16基因兩側(cè)的同源序列發(fā)生同源重組，從而實(shí)現(xiàn)了FAS2基因的過表達(dá)盒整合到釀酒酵母染色體上。同源重組過程如圖3。將導(dǎo)入片段的菌液涂布在含有1000 mg/L G418抗性的YEPD平板上，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。分別以長(zhǎng)勢(shì)較好的轉(zhuǎn)化子基因組為模板，以出發(fā)菌株α5F-FAS1及α5O-FAS1的基因組為陰性對(duì)照，分別用三對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證過程如圖4。

圖4 突變株的驗(yàn)證過程Fig.4 The verification of transformants

引物對(duì)Ⅰ：Hxt16驗(yàn)-U/KAN-D進(jìn)行上游定點(diǎn)PCR驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條大小約2655 bp左右的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)，而出發(fā)菌株無法擴(kuò)增出條帶。

引物對(duì)Ⅱ：KAN-U/PGK1P-D進(jìn)行中游定點(diǎn)PCR驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條大小約3092 bp左右的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)，而出發(fā)菌株無法擴(kuò)增出條帶。

引物對(duì)Ⅲ：PGK1T-U/Hxt16驗(yàn)-D進(jìn)行下游定點(diǎn)PCR驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條大小約3553 bp左右的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)，而出發(fā)菌株無法擴(kuò)增出條帶。說明片段已經(jīng)成功連接并整合到釀酒酵母單倍體基因組中的HXT16位點(diǎn)，得到FF1F2和OF1F2突變株。結(jié)果如圖5所示。

圖5 突變株α5F-FAS1,2的驗(yàn)證Fig.5 The verification of transformants α5F-FAS1,2

2.2 出發(fā)菌株與突變菌株的發(fā)酵性能比較

按照方法 1.2.5以出發(fā)菌株α5為對(duì)照菌株與α5F-FAS1、FF1F2、α5O-FAS1、OF1F2同時(shí)進(jìn)行玉米原料發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定各菌株的基本發(fā)酵性能。

由表2可知，與出發(fā)菌株α5相比，敲除FAA1同時(shí)過表達(dá)FAS1基因后突變菌和敲除OPI1同時(shí)過表達(dá)FAS1基因后突變菌的主要發(fā)酵性能總CO2失重、酒精度和殘?zhí)菦]有明顯的影響。在過表達(dá)FAS1基因的基礎(chǔ)上過表達(dá)FAS2的主要發(fā)酵性能也未受明顯影響。

表2 突變株的發(fā)酵性能比較Table 2 The comparison of the fermentation performance of mutants

2.3 共表達(dá)FAS1，F(xiàn)AS2基因?qū)χ墟溨舅嵋阴ド闪康挠绊?/p>

發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵醪進(jìn)行蒸餾，獲得的酒樣經(jīng)過頂空萃取和吸附后，用GC-MS檢測(cè)分析酒樣中己酸乙酯等脂肪酸乙酯生成量。

圖6 出發(fā)菌株和突變菌株中鏈脂肪酸乙酯的生成量比較Fig.6 The comparison of medium chain fatty acid ethyl esters production between original strain and recombinant strains

如圖6所示，相比較于α5F-FAS1菌株，在此基礎(chǔ)上共表達(dá)FAS2的菌株的FF1F2的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯分別提升了 154.31%，65.22%和23.53%，但十二酸乙酯、十四酸乙酯基本不變。與此結(jié)果類似：相比較于α5O-FAS1菌株，在此基礎(chǔ)上共表達(dá)FAS2的菌株的OF1F2的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯分別提升了17.34%，30.71%，27.12%和28.13%，但十四酸乙酯基本不變。結(jié)果顯示共表達(dá)FAS1和FAS2基因可以更進(jìn)一步的提升中鏈脂肪酸乙酯的產(chǎn)量，特別是己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的產(chǎn)量，最終的最高產(chǎn)量分別達(dá)到4.049 mg/L，3.89 mg/L，2.34 mg/L。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 Furukawa等在清酒酵母中過表達(dá)FAS1可以提高己酸乙酯，并且共表達(dá)FAS1和FAS2可以使己酸乙酯的產(chǎn)量達(dá)到最大的結(jié)論一致[16]。由于脂肪酸合成酶是由兩個(gè)亞基組成，它們對(duì)于脂肪酸合成酶的酶活力都有貢獻(xiàn)，并且編碼β亞基的基因FAS1其主要作用，其可以在RNA水平上調(diào)節(jié)編碼α亞基的基因FAS2的表達(dá)，從而提高脂肪酸合成酶的酶活力。并且同時(shí)共表達(dá)FAS1和FAS2使得α亞基和β亞基以等摩爾的形式存在[17]，從而使脂肪酸合成酶達(dá)到最大的酶活力，進(jìn)一步提升了中鏈脂肪酸乙酯的含量。

2.4 共表達(dá)FAS1，F(xiàn)AS2基因?qū)σ宜嵋阴ド闪康挠绊?/p>

本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)FAS1可以提高乙酸乙酯的生成量。突變株的乙酸乙酯及乙酸的生成量結(jié)果如表3。

表3 過表達(dá)FAS1和共表達(dá)FAS1,2的乙酸乙酯和乙酸產(chǎn)量Table 3 The production of Acetate and Ethyl ester between Co-overexpression of FAS1 and FAS2 strains and overexpression of FAS1 strains

從表3可以看出，過表達(dá)FAS1可以提高乙酸乙酯的含量同時(shí)降低乙酸的含量。而共表達(dá) FAS1,2會(huì)進(jìn)一步提高乙酸乙酯并降低乙酸的含量。并且敲除Opi1過表達(dá)FAS1的菌株α5O-FAS1比敲除FAA1過表達(dá)FAS1的菌株α5F-FAS1產(chǎn)生的乙酸乙酯更高，同樣共表達(dá)FAS1,2的菌株OF1F2比FF1F2產(chǎn)生的乙酸乙酯更高。說明不同整合位點(diǎn)對(duì)乙酸乙酯的生成量也有影響。

圖7 釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)acetyl-CoA的代謝途徑Fig.7 The metabolic pathway of acetyl-CoA in cytoplasm in S.cerevisiae

圖7是釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)中乙酰CoA的代謝途徑，由于在細(xì)胞質(zhì)中乙酰 CoA一部分在醇乙?；D(zhuǎn)移酶Atf1p和Atf2p催化下形成乙酸乙酯，另一部分通過脂肪酸合成途徑形成脂肪酸乙酯，因此實(shí)際上脂肪酸合成途徑和乙酸乙酯合成途徑存在相互競(jìng)爭(zhēng)底物乙酰CoA的情況，當(dāng)過表達(dá)FAS基因后，理論上乙酸乙酯的生成量應(yīng)該降低。因此表3的結(jié)果似乎與理論不符。

由于過表達(dá)FAS1導(dǎo)致了乙酸的降低，癌癥細(xì)胞的背景與此現(xiàn)象類似。相比較于正常細(xì)胞，癌細(xì)胞的脂肪酸合成能力變強(qiáng)，同時(shí)大部分癌細(xì)胞存在于低氧低營(yíng)養(yǎng)的惡劣環(huán)境中，許多研究學(xué)者都發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞通過ACSS基因的上調(diào)，從而利用乙酸維持癌細(xì)胞的存活[18,19]。猜測(cè)乙酸乙酯升高的第一種原因可能是過表達(dá)脂肪酸合成酶基因使乙酰 CoA的上游途徑基因ACS1或ACS2基因上調(diào)。另一方面由于乙酸乙酯主要是由醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶Atf1p催化，并且ATF1基因會(huì)受到氧氣，氮信號(hào)，不飽和脂肪酸等的調(diào)控[20,21]。因此猜測(cè)乙酸乙酯升高的第二種原因是過表達(dá)脂肪酸合成酶基因可能使乙酸乙酯的調(diào)控基因ATF1上調(diào)。

為了探究本現(xiàn)象，以出發(fā)菌株α5和突變株α5O-FAS1進(jìn)行玉米原料發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)48 h取菌體提RNA進(jìn)行RT-PCR。

圖8 α5和α5O-FAS1中ACS1，ACS2，F(xiàn)AS2，ATF1的基因表達(dá)量Fig.8 Determination of ACS1, ACS2, FAS2, ATF1 gene expression levels in α5 and α5O-FAS1

如圖8，F(xiàn)AS1基因過表達(dá)并未影響ACS1基因的表達(dá)量，但會(huì)提高ACS2的和ATF1基因的表達(dá)量，分別提高了4.75倍和2.93倍，同時(shí)也使FAS2基因表達(dá)量提高了2.11倍。因此過表達(dá)FAS1導(dǎo)致乙酸乙酯的升高一方面可能是由于ACS2基因的表達(dá)量上調(diào)導(dǎo)致的，另一方面也可能是由于ATF1基因的表達(dá)量上調(diào)導(dǎo)致的。

一方面為了進(jìn)一步確定乙酸乙酯的上升是由于哪一種原因造成的，另一方面為了探索不同整合位點(diǎn)導(dǎo)致乙酸乙酯提升程度不同的原因，本研究以α5，α5F-FAS1，α5O-FAS1為出發(fā)菌株，同時(shí)過表達(dá)ATF1基因，得到α5-ATF1，F(xiàn)F1-ATF1，OF1-ATF1三株突變株，進(jìn)行玉米白酒液態(tài)發(fā)酵。氣相測(cè)定乙酸乙酯及乙酸產(chǎn)量如表4。同時(shí)測(cè)定了α5，α5F-FAS1，α5O-FAS1菌株的FAS1和FAS2基因的表達(dá)量。

表4 過表達(dá)ATF1和共表達(dá)FAS1,ATF1的乙酸乙酯和異戊醇產(chǎn)量Table 4 The production of higher alcohols and estersbetween Co-overexpressionof FAS1 and ATF1 strains and overexpressionof ATF1 strains

表 4結(jié)果顯示與α5-ATF1相比，F(xiàn)F1-ATF1和OF1-ATF1的乙酸乙酯產(chǎn)量分別為277.1 mg/L和73.7 mg/L，出現(xiàn)逐漸遞減的現(xiàn)象。假如脂肪酸合成途徑的強(qiáng)化導(dǎo)致乙酸乙酯的升高是ACS2基因的表達(dá)量上調(diào)導(dǎo)致的，那么過表達(dá) ATF1基因后，菌株 FF1-ATF1和OF1-ATF1生成的乙酸乙酯量應(yīng)該比α5-ATF1菌株的高。此結(jié)果可以說明脂肪酸合成途徑的強(qiáng)化導(dǎo)致乙酸乙酯的升高并不是ACS2基因的表達(dá)量導(dǎo)致的，而是由于ATF1基因的表達(dá)量上調(diào)造成的。

圖9 α5，α5F-FAS1和α5O-FAS1中FAS1，F(xiàn)AS2的基因表達(dá)量Fig.9 Determination of FAS1 and FAS2 gene expression levels in α5, α5F-FAS1 and α5O-FAS1

圖9顯示整合Opi1過表達(dá)FAS1的菌株α5O-FAS1比整合FAA1過表達(dá)FAS1的菌株α5F-FAS1的FAS2的基因表達(dá)量更高。該結(jié)論與表3-2所出現(xiàn)的共表達(dá)FAS1和FAS2的菌株比單獨(dú)過表達(dá)FAS1產(chǎn)生更多的乙酸乙酯相符合。結(jié)果說明菌株α5O-FAS1比菌株α5F-FAS1產(chǎn)生的乙酸乙酯更高，是由于Opi1基因是脂肪酸合成途徑的負(fù)調(diào)控基因[22]，其敲除強(qiáng)化了脂肪酸合成途徑導(dǎo)致的。

3 結(jié)論

3.1 本研究以釀酒酵母AY15的單倍體α5基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到編碼α亞基的FAS2基因，經(jīng)醋酸鋰轉(zhuǎn)化和G418抗性篩選鑒定獲得共表達(dá)FAS1和FAS2基因的突變株α5F-FAS1,2和α5O-FAS1,2。經(jīng)玉米原料發(fā)酵后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變株的生長(zhǎng)速度、發(fā)酵速度、酒精度等基本發(fā)酵性能都沒有明顯變化。相比較于單獨(dú)過表達(dá)FAS1基因，共表達(dá)FAS1和FAS2基因可以更進(jìn)一步的提升中鏈脂肪酸乙酯的生成量，最終α5F-FAS1,2的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯分別提升了 154.31%，65.22%和 23.53%，同時(shí)α5F-FAS1,2的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯分別提升了 17.34%，30.71%，27.12%和28.13%。

3.2 本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)脂肪酸合成酶的編碼基因可以提高乙酸乙酯的生成量。通過RT-PCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成酶編碼基因的過表達(dá)可以使ACS2和ATF1基因上調(diào)，不影響ACS1基因的表達(dá)。而與單獨(dú)過表達(dá)ATF1基因的菌株相比，共表達(dá)FAS1和ATF1的菌株的乙酸乙酯逐漸降低。因此過表達(dá)FAS1導(dǎo)致的乙酸乙酯生成量上升的現(xiàn)象主要是由于過表達(dá)脂肪酸合成酶編碼基因使得醇?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因ATF1的表達(dá)量上升造成的。但ATF1的表達(dá)量上調(diào)的原因是否是通過某些中間調(diào)節(jié)因子造成尚不清楚，需要在后續(xù)在調(diào)控機(jī)理上進(jìn)行更深入的研究。

3.3 本研究初步探討了脂肪酸合成酶復(fù)合體對(duì)釀酒酵母中鏈脂肪酸乙酯生成的影響，為后續(xù)研究中鏈脂肪酸乙酯合成的調(diào)控機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。