張會敏，邢新會,2，王 越，崔 磊，王秀本，常 強，孫 偉，席鮮會，薛正蓮,*

（1.安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實驗室，安徽 蕪湖 241000；2.清華大學化學工程系，北京 100084；3.安徽文王釀酒股份有限公司，安徽 臨泉 236400）

濃香型白酒是我國十二大香型白酒（濃香、醬香、清香、米香、芝麻香、馥郁香、老白干、豉香、藥香、特香、兼香、鳳香）之一，其產(chǎn)量和銷量占白酒總量的70%以上[1]，因此，提高其發(fā)酵質量非常重要。占白酒含量約2%的風味物質中，四大酯（乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯）對白酒品質影響最大[2]。在濃香型白酒中，就相對含量來說，己酸乙酯的相對含量（62.28%）最多，乳酸乙酯的相對含量（12.51%）最少；就評估酯類香氣貢獻的主要參數(shù)氣味活性值（odorant activity value，OAV）和風味稀釋因子（flavor dilution factor，F(xiàn)D）來說，己酸乙酯的OAV（26 890～137 558）和FD（4 096～59 049）遠大于其余三者，而乳酸乙酯的OAV（5～8）和FD（1～32）最小[3]。在GB/T 10781.1—2021《白酒質量要求第1部分：濃香型白酒》中，己酸乙酯被定義為主要特征風味物質。己酸乙酯對濃香型白酒兼具菠蘿香與辛辣味的獨特酒香風味貢獻最大[2-3]。質量較好的“優(yōu)級”濃香型白酒中己酸乙酯的含量是普通一級濃香型白酒的175%～200%。因此，增加濃香型白酒中己酸乙酯的含量，降低乳酸乙酯的含量，即“增己降乳”是提高濃香型白酒發(fā)酵質量的有效途徑[2-5]。己酸乙酯和乳酸乙酯分別由己酸和乳酸與乙醇通過酯化反應生成，因此，在發(fā)酵過程中，增加己酸產(chǎn)量同時降低乳酸產(chǎn)量有助于提高釀酒品質。

濃香型白酒的發(fā)酵是在傳統(tǒng)泥窖中經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾、陳釀、勾調(diào)而成，不直接或者間接添加非自身發(fā)酵產(chǎn)生的風味物質。因此，己酸的合成代謝對濃香型白酒的發(fā)酵質量具有重要影響[6]。以乳酸為底物的己酸合成代謝有利于提高濃香型白酒的發(fā)酵質量。濃香型白酒發(fā)酵體系中的己酸生成菌（以下簡稱“己酸菌”）主要聚居于窖泥[7]。己酸菌在老窖池窖泥中的豐度比新窖池窖泥中的豐度高約2 個數(shù)量級[8]。在發(fā)酵過程中，以高粱為主的糧食與大曲混合物被封存在窖泥中進行厭氧分批發(fā)酵（圖1B）。每批次的濃香型白酒發(fā)酵階段可以被分為發(fā)酵前期（0～25 d）和發(fā)酵后期[9]。在以合成乙醇為主的兼性發(fā)酵前期，微生物代謝形成包括水、醇、酸、酯等各種成分的液態(tài)混溶物“黃水”。在發(fā)酵后期，包括己酸菌在內(nèi)的厭氧菌從窖泥遷移到酒醅-黃水固液混合物中，進行厭氧代謝[9]。在每批次發(fā)酵過程中，黃水中己酸菌的豐度隨發(fā)酵后期的延長而逐漸增加[10]；而且，黃水中己酸菌的豐度隨著發(fā)酵批次的增加而增加[11]。發(fā)酵結束后，一個窖池中最好的濃香型白酒往往來自與黃水共存的底層酒醅。具有較高豐度己酸菌的窖池傾向用于生產(chǎn)較高質量的濃香型白酒，正所謂“千年老窖萬年糟，好酒全憑窖池老”。因此，有些濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)通過在生產(chǎn)批次中間向窖泥噴灑己酸菌液的方式（圖1），或者制作高質量人工窖泥的方式提高包括己酸菌在內(nèi)的窖泥菌群豐度，從而提高釀酒質量[12-13]。此外，己酸作為一種能源物質，以乙醇、乳酸等為底物合成己酸的己酸菌對釀酒廢棄物的轉化利用也具有重要作用[14-17]。

圖1 提高濃香型白酒發(fā)酵質量的噴灑己酸菌液方法（A）和濃香型發(fā)酵過程（B）中己酸菌群協(xié)同代謝（C）Fig.1 CPBs spraying method to improve the fermentation quality of CSFB (A),schematic of CSFB fermentation (B),and schematic of CPBs co-metabolism (C) during CSFB fermentation

基于己酸菌對濃香型白酒發(fā)酵的重要性，本文深入分析濃香型白酒發(fā)酵體系中己酸菌的種類多樣性、系統(tǒng)進化關系、生理代謝特征、合成代謝己酸機制及其在濃香型白酒發(fā)酵體系的復雜代謝環(huán)境中與己酸菌、非己酸菌之間的協(xié)同代謝關系，探究己酸菌群在濃香型白酒發(fā)酵體系中的生長代謝規(guī)律，旨在為人工干預調(diào)控己酸菌的生長代謝以提升濃香型白酒發(fā)酵質量提供理論依據(jù)。

1 濃香型白酒發(fā)酵體系中己酸菌群組成分析

己酸菌作為一種產(chǎn)生高附加值中鏈脂肪酸的能源菌已有近百年研究歷史。目前從自然環(huán)境分離的己酸菌屬[18]有梭菌屬（Clostridium）、Megasphaera、Caproiciproducens[19]、Eubacterium、Rhodospirillum、Pseudoramibacter、Caproicibacterium[20]、Rummeliibacillus[21]和Enterococcus[22]。在濃香型白酒發(fā)酵體系中，窖泥作為己酸菌的主要分離源，其表層的己酸菌豐富[8]。目前，從濃香型白酒發(fā)酵體系中分離純化并鑒定的己酸菌株主要屬于Clostridium、Caproicibacterium、Enterococcus和Rummeliibacillus。此外，通過現(xiàn)代高通量測序技術證實其中廣泛存在Caproiciproducens[1,8-9,23-26]及未鑒定的Clostridium[27]。己酸菌株Ruminococcaceae bacterium CPB6最初分離時沒有確定菌屬[28]，后經(jīng)過基因組學分析將其歸為Caproicibacterium[29]。本研究查詢了典型己酸菌株的16S rRNA基因序列，利用MEGA軟件構建其與非濃香型白酒發(fā)酵體系來源己酸菌株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，以分析己酸菌株之間的進化關系，如圖2所示。

圖2 通過代表己酸菌株16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of representative CPBs based on 16S rRNA gene sequences

總結來說，目前從濃香型白酒發(fā)酵體系分離的己酸菌株主要集中在梭菌科（Clostridiaceae）和顫螺菌科（Oscillospiraceae）[30]，與通過高通量測序技術檢測到的數(shù)據(jù)基本一致[8,29,31]。其中，從濃香型白酒發(fā)酵體系分離的Oscillospiraceae己酸菌株主要是新近分離的Caproicibacterium菌株，與從非濃香型白酒發(fā)酵體系分離的己酸菌株有一定遺傳距離，親緣性較遠。Clostridiaceae的己酸菌株主要為Clostridium；濃香型白酒發(fā)酵體系來源的Clostridiaceae與非濃香型白酒發(fā)酵體系來源的Clostridiaceae親緣關系更近。已經(jīng)報道的從濃香型白酒發(fā)酵體系中分離的Clostridium有Clostridiumsp.EFAS6[32]、Clostridiumbeijerinckii[33]、ClostridiumbutyricumJKY6D1[34]、Clostridiumtertium、Clostridiumpabulibutyricum和Clostridiumintestinale[31]，其與非濃香型白酒發(fā)酵體系來源的Clostridium組成類似，這進一步證實濃香型白酒和非濃香型白酒發(fā)酵體系來源的Clostridum己酸菌的親緣性更高。此外，從濃香型白酒發(fā)酵體系中還分離了兩株分別來自動球菌科（Planococcaceae）和腸球菌科（Enterococcaceae）的己酸菌株。Zhang Huimin等[8]通過現(xiàn)代高通量測序分析窖泥菌群結構發(fā)現(xiàn)，尚未分離的3 個科（Eubacteriaceae、Veillonellaceae和Rhodospirillaceae）存在于窖泥菌群中。其中Eubacteriaceae的相對豐度稍高（1.75%～4.41%），Veillonellaceae和Rhodospirillaceae的相對豐度甚微。從濃香型白酒發(fā)酵體系中分離的己酸菌株代謝特征有所差異，Oscillospiraceae菌株普遍適宜弱酸性pH值（可低至4.5），以乳酸、淀粉和葡萄糖為代謝底物[20,28,35]，Clostridiaceae、Planococcaceae與Enterococcaceae菌株適宜弱酸性或中性pH值，以乙醇和葡萄糖為底物[21,31,36-37]。窖泥的多維理化環(huán)境為適宜不同理化條件的己酸菌提供了生長環(huán)境[8]。同時，適宜在不同理化條件下生存的己酸菌群為高效轉化濃香型白酒發(fā)酵體系中豐富多樣的底物（如乳酸、淀粉和葡萄糖等）創(chuàng)造了生理生化條件。而且隨著窖池窖齡的增加，己酸菌豐度逐漸增加[38-39]，其合成己酸的能力越來越增強。增加濃香型白酒發(fā)酵體系中可以將乳酸轉化成己酸的己酸菌相對豐度對提高濃香型白酒的發(fā)酵質量尤其重要[2-5]。最近通過16S rDNA高通量測序分析表明，濃香型白酒發(fā)酵體系中主要以乳酸為電子供體的己酸菌（如Caproicibacterium、Caproiciproducens）的相對豐度大于以乙醇為電子供體的己酸菌（如Clostridium）[29]。

綜上所述，隨著培養(yǎng)組學的發(fā)展，包括己酸菌在內(nèi)越來越多的菌株從窖泥中純化出來[40-41]。值得注意的是，通過對比宏基因組數(shù)據(jù)與分離純化菌株信息，仍然有大量潛在己酸菌未能實現(xiàn)分離純化。分析其原因，一方面有可能與有些己酸菌的低豐度和難培養(yǎng)性有關；另一方面，與現(xiàn)有的傳統(tǒng)分離純化菌株需要培養(yǎng)基制作、傾倒平板、稀釋涂布、菌落挑取、生化/測序鑒定等大量基礎性重復操作流程所固有的耗時、耗力、耗錢且通量極低的特點有關。因此，濃香型白酒發(fā)酵體系中更多潛在新己酸菌的分離篩選需要借助厭氧微生物分離培養(yǎng)新技術的發(fā)展[32,42]，如集高通量分離、培養(yǎng)、鑒定于一體的新型菌群培養(yǎng)組學技術與裝備[42]。

經(jīng)過分子生物學鑒定的典型己酸菌株匯總如表1所示。

表1 一些從濃香型白酒發(fā)酵體系中分離的己酸菌株詳情Table 1 Details of caproic acid-producing bacteria isolated from CSFB fermentation ecosystem

2 濃香型白酒發(fā)酵體系中己酸菌代謝合成己酸機制

在發(fā)酵前期，濃香型白酒發(fā)酵體系中積累了葡萄糖、乳酸、乙醇、乙酸、丁酸等可以用于己酸合成代謝的底物。發(fā)酵前期是己酸合成代謝底物準備階段。到發(fā)酵后期，己酸合成的底物隨液態(tài)黃水聚集，為從窖泥遷移到黃水的己酸菌進行己酸合成代謝創(chuàng)造了理化環(huán)境[50-53]。

己酸菌合成己酸的主體代謝反應又被稱為碳鏈延長反應。碳鏈延長反應包括最早在克氏梭菌（Clostridium kluyveri）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的β-氧化逆反應（reverseβ-oxidation，RBO）途徑[54]和新近在禽波氏桿菌（Bordetellaavium）、某種浮霉菌科（Planctomycetaceae）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的脂肪酸合成反應（fatty acid biosynthesis，F(xiàn)AB）途徑[55]。在濃香型白酒發(fā)酵體系的己酸菌體內(nèi)普遍存在RBO途徑[29,56-57]。目前尚無直接證據(jù)表明在濃香型白酒發(fā)酵過程中己酸菌群通過FAB途徑合成己酸。然而，在通過以己酸菌屬Caproiciproducens為主的己酸菌群進行以釀酒廢水為底物的己酸合成代謝反應中，發(fā)現(xiàn)己酸菌群通過RBO和FAB兩種代謝途徑協(xié)同合成己酸[58]。

在濃香型白酒發(fā)酵體系中進行的主要己酸合成代謝反應途徑如圖3所示。RBO和FAB代謝途徑均需要作為電子供體的底物提供電子，形成中間代謝物乙酰輔酶A。乙醇和乳酸是目前已知RBO途徑中兩種最常用的電子供體，其首先需要分別在乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶的作用下形成中間代謝物乙酰輔酶A，然后與作為電子受體的短鏈脂肪酸（如乙酸、丁酸）結合使其增加兩個碳，完成一次RBO鏈延長反應（循環(huán)）。在FAB碳鏈延長反應中，乙酰輔酶A首先需要在羧化酶的作用下形成丙二酰輔酶A，它作為C2供體在轉移酶的作用下連接到?；D運蛋白（acyl carrier protein，ACP）上，進入循環(huán)的FAB碳鏈延長反應。相比于FAB途徑，RBO途徑更高效，因為FAB途徑所需要的ACP會消耗更多ATP[55]。目前，RBO途徑多被作為碳鏈延長反應的模式途徑，因為以Clostridiumkluyveri和Ruminococcaceae bacterium CPB6為代表的模式菌株體內(nèi)具有進行RBO循環(huán)的全部酶，通過單菌株代謝即可進行碳鏈延長反應，生成目標產(chǎn)物己酸?？梢詤⑴cFAB代謝的菌株普遍存在缺失FAB代謝酶系的情況，因此，F(xiàn)AB代謝途徑存在于通過混合己酸菌群而非純菌進行的己酸合成代謝體系中。RBO途徑與FAB途徑共同所需的中間代謝物乙酰輔酶A，主要是以代謝體系中的底物葡萄糖、己酸和乙醇等作為電子供體代謝形成丙酮酸，然后通過丙酮酸脫氫酶代謝形成乙酰輔酶A。梭菌屬（Clostridium）的己酸菌株主要以乙醇為電子供體進行RBO碳鏈延長反應[32-34,36-37,46,48]；顫螺菌科（Oscillospiraceae）的己酸菌株主要進行以乳酸為底物和電子供體的RBO鏈延長反應[20,28-29,45]。很多菌具有轉化淀粉、葡萄糖為己酸的代謝能力（表1）。腸球菌EnterococcuscasseliflavusBF-1與魯梅爾芽胞桿菌Rummeliibacillussuwonensis3B-1可以以乙醇或葡萄糖為底物和電子供體進行RBO碳鏈延長反應[21-22]。在復雜的濃香型白酒發(fā)酵體系中，己酸菌群經(jīng)過不斷地分批發(fā)酵馴化，逐漸產(chǎn)生對外界環(huán)境的適應性[29,59]。

圖3 濃香型白酒發(fā)酵體系中主要己酸合成代謝的代謝通路[60]Fig.3 Major caproic acid synthesis pathways in CSFB fermentation ecosystem[60]

綜上所述，濃香型白酒發(fā)酵體系中同時存在可以轉化葡萄糖、乙醇和乳酸通過RBO碳鏈延長反應生成己酸的菌株。此外，具有不同代謝功能的復合己酸菌株還可以額外借助FAB代謝通路合成己酸。己酸菌群在濃香型白酒發(fā)酵體系中的己酸合成機制相對復雜，需要深入分析其協(xié)同代謝機制。

3 濃香型白酒發(fā)酵體系己酸菌群的協(xié)同代謝機制

目前對濃香型白酒發(fā)酵體系中己酸菌的研究主要集中在己酸菌株的分離、純化、代謝特征分析以及其與協(xié)同菌株的協(xié)同代謝關系。理論上，目前所知濃香型白酒發(fā)酵體系中的己酸菌只可以通過RBO途徑進行己酸合成代謝，混合菌群可以同時通過RBO和FAB途徑進行協(xié)同己酸合成代謝。在實際濃香型白酒固液雙相發(fā)酵體系中，與“黃水”共存的酒醅菌群與窖泥菌群被證實在己酸合成代謝中存在協(xié)同合作，前者用于乙酸、乳酸等底物準備，后者用于丁酸和己酸等產(chǎn)物生成[61]。Clostridiaceae的Clostridium被發(fā)現(xiàn)主要進行以乙醇為底物和電子供體的丁酸合成[62]，為己酸菌的己酸合成提供了電子受體丁酸；Oscillospiraceae的Caproiciproducens主要進行以乳酸為底物和電子供體的己酸合成[17]，己酸菌在己酸合成過程中存在協(xié)同代謝。己酸菌Caproiciproducens、Clostridium與非己酸菌Lactobacillus協(xié)同代謝過程中，Lactobacillus可提供Caproiciproducens用于己酸合成代謝的底物兼電子供體乳酸；同時Caproiciproducens轉化乳酸形成乙酰輔酶A所釋放的CO2促進了乙醇向乙酰輔酶A的轉化[17]。即濃香型白酒發(fā)酵體系中相對豐度最高的兩個己酸菌群Clostridiaceae與Oscillospiraceae在己酸合成代謝過程中具有協(xié)同性。非己酸菌株NovisyntrophococcusfermenticellaeJN500902被證實可通過與己酸菌株ClostridiumfermenticellaeJN500901共享代謝底物促進丁酸、己酸合成[63]。通過平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)以乳酸為底物的己酸菌株C.lactatifermentansLBM19010、C.lactatifermentansJNU-WLY1368與Clostridiaceae的菌株具有生長協(xié)同性[29]。通過菌群之間的共發(fā)生網(wǎng)絡分析證實，老窖池中豐度更高的己酸菌群受大曲菌群的影響與酒醅（黃水）菌群協(xié)同作用更強[64-65]。Clostridium與Caproiciproducens均與氫營養(yǎng)型的甲烷絲菌屬Methanosaeta具有較強正相關，而且主要以乳酸為電子供體生成己酸的Oscillospiraceae整體與甲烷葉菌屬Methanolobus、Methanoplasma、甲烷細菌屬Methanobacterium均具有較強相關性[66]。以上結論與己酸菌和氫轉移菌之間的協(xié)同代謝作用有利于己酸合成代謝的結論一致[65,67]。在非濃香型白酒的己酸生成代謝體系中己酸菌與酵母菌、甲烷菌、放線菌之間普遍存在共生關系[68]。窖泥菌群中普遍存在未分離的潛在己酸菌與非己酸菌之間具有共生或者代謝相關性的現(xiàn)象[69]。在濃香型白酒發(fā)酵體系中，己酸菌株Clostridiumkluyveri與己酸菌[63,70-72]和產(chǎn)生乙酸的菌Acetobacterium[73]、產(chǎn)生丙酸的菌[74]、分解纖維素的菌[75]等非己酸菌之間也存在協(xié)同代謝關系。

綜上，濃香型白酒發(fā)酵體系中己酸菌群資源豐富，眾多類似功能的己酸菌群具有多底物代謝功能冗余性[76]。濃香型白酒發(fā)酵體系中復合己酸菌群的多底物代謝功能冗余性使其在低pH值（3.15～3.77）、低還原糖、低水分活度的非適宜己酸菌代謝環(huán)境中[51-52]，可通過己酸菌群內(nèi)以及與非己酸菌之間產(chǎn)生協(xié)同代謝效應，更容易實現(xiàn)單一菌株很難實現(xiàn)的多種底物高效降解，進而生長繁殖、合成己酸[60]。己酸菌群作為濃香型白酒發(fā)酵體系中具有己酸合成功能的一類菌群，需要與濃香型白酒發(fā)酵代謝協(xié)同一起參與己酸的合成代謝；己酸菌群亦可利用發(fā)酵副產(chǎn)物中糖類、乳酸和乙醇的轉化合成己酸，通過合成微生物共培養(yǎng)物提高生物工藝是目前重要的研究方向[77]，其作為合成培養(yǎng)工程的一部分可以提供比單菌發(fā)酵更優(yōu)越的生物過程工藝[60,78]。關于濃香型白酒發(fā)酵體系中己酸菌與己酸菌和非己酸菌之間的協(xié)同代謝機制，尚有大量空白有待進一步研究，比如己酸菌群從新窖泥非優(yōu)勢地位到老窖泥優(yōu)勢地位的更迭進化過程中，己酸菌群與己酸菌群、非己酸菌群協(xié)同代謝機制以及窖泥理化微環(huán)境的變化規(guī)律。對濃香型白酒發(fā)酵體系中己酸菌群協(xié)同合成己酸機制的解析有利于靶向提高濃香型白酒發(fā)酵品質，也能夠為通過己酸菌群合成高附加值己酸提供理論基礎。

4 結語

己酸菌群作為濃香型白酒發(fā)酵菌群的重要組成部分，加強其己酸合成功能有助于提高己酸產(chǎn)量，從而提高己酸乙酯的產(chǎn)量，這對改善濃香型白酒的發(fā)酵品質非常重要。近年來，隨著基因組學與培養(yǎng)組學技術的發(fā)展，濃香型白酒發(fā)酵體系作為一個天然的己酸菌群富集馴化庫，其中己酸菌的分離純化、己酸合成生理代謝特征、己酸合成機制和協(xié)同代謝多樣性研究獲得飛速發(fā)展。目前，從濃香型白酒發(fā)酵體系分離的己酸菌株主要屬于Oscillospiraceae和Clostridiaceae。由于不同菌屬的己酸代謝特征差異，適宜在不同的理化條件下進行己酸合成代謝，例如Oscillospiraceae的己酸菌比較適宜弱酸性環(huán)境，Clostridiaceae的己酸菌比較適宜中性環(huán)境。濃香型白酒發(fā)酵體系己酸菌均可通過RBO途徑合成己酸，其中Oscillospiraceae傾向于以乳酸為電子供體生成乙酰輔酶A進入RBO途徑合成己酸，而Clostridiaceae傾向于以乙醇為電子供體生成乙酰輔酶A進入RBO途徑合成己酸。兩者均可代謝速效碳源葡萄糖。此外，己酸菌群具有協(xié)同通過FAB代謝途徑合成己酸的潛力。在濃香型白酒發(fā)酵體系中，己酸菌與己酸菌、非己酸菌之間普遍存在協(xié)同代謝關系，這有助于綜合利用代謝環(huán)境的各種碳源和差異化理化環(huán)境，且有助于提高己酸菌群的己酸合成功能。

相信隨著培養(yǎng)組學的發(fā)展，借助集高通量分離、培養(yǎng)、鑒定于一體的新型菌群培養(yǎng)組學技術與裝備，將從濃香型白酒發(fā)酵體系中分離鑒定出越來越多的己酸菌株。同時，更多己酸菌株的己酸合成代謝特征解析有助于了解濃香型白酒發(fā)酵體系中復雜的混合菌群協(xié)同代謝機制。