史清照，劉富強(qiáng)，張啟東，范 武，柴國璧，毛 健,2，王煥麗，姬凌波，馮偉華，宗國浩，曹培健，盧 鵬，謝劍平,2,*

（1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001；2.北京生命科技研究院，北京 102299）

喜愛甜味是人類的本能，人類在嬰兒時(shí)期就表現(xiàn)出明顯的甜味偏好[1]，而甜味引發(fā)的大腦獎(jiǎng)賞區(qū)域神經(jīng)活動(dòng)和多巴胺（dopamine，DA）的釋放則闡釋了這一現(xiàn)象的深層生物學(xué)機(jī)制[2-3]。人類文明初期，甜味主要源于鮮果、蜂蜜和其他植物中的天然小分子糖類。隨著農(nóng)業(yè)和手工業(yè)的發(fā)展，世界各地先后以谷物、甘蔗、甜菜等為原料，創(chuàng)造性地開發(fā)出含有較高麥芽糖（飴）、蔗糖等糖類的甜食?！对娊?jīng)》中有“周原膴膴，堇荼如飴”的詩句，以甜美的飴糖贊美周人的故土，可見早在周代飴糖已是生活中常見的食品。

隨著工業(yè)革命的發(fā)生，尤其是二戰(zhàn)后工業(yè)與農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的結(jié)合，全球越來越多的經(jīng)濟(jì)體呈現(xiàn)食物和營養(yǎng)供給日益過剩的趨勢(shì)；由于對(duì)甜味的本能喜愛，高糖高甜度食品備受消費(fèi)者青睞，但同時(shí)也帶來了諸如糖尿病、肥胖等健康問題。國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）2021年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患病率持續(xù)增長，相比于2019年，2021年全球成年糖尿病患者人數(shù)增加了16%，約占全球成年人口的10.5%[4-5]。

在這一全球健康風(fēng)險(xiǎn)背景下，許多國家開始實(shí)施政策以降低本國居民的糖類攝入量[6]。我國各級(jí)政府機(jī)構(gòu)已出臺(tái)多項(xiàng)政策或計(jì)劃，呼吁人們控制日常糖分?jǐn)z入、倡導(dǎo)減糖生活。在各方倡導(dǎo)下，利用甜味劑代替糖類提供甜味感受的產(chǎn)品在食品產(chǎn)業(yè)界和消費(fèi)者群體中受到更多關(guān)注。甜味劑通常以更少的劑量提供與糖類同等強(qiáng)度的甜味，同時(shí)不影響血糖水平，也不會(huì)導(dǎo)致肥胖、齲齒等健康問題，滿足了消費(fèi)者獲取甜味享受和降低健康風(fēng)險(xiǎn)的雙重需求。目前全球范圍內(nèi)無糖或低糖類產(chǎn)品數(shù)量迅速增加，這些產(chǎn)品都應(yīng)用了不同類型的甜味劑。

甜味劑根據(jù)來源分為人工甜味劑和天然甜味劑兩種類型。1879年，美國約翰·霍普金斯大學(xué)研究人員偶然品嘗了所合成的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)烈的甜味并將其命名為“糖精”，這是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)并獲得大規(guī)模應(yīng)用的人工甜味劑[7]。隨后甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜和三氯蔗糖等不同類型的人工甜味劑陸續(xù)被開發(fā)出來，且無一例外出于實(shí)驗(yàn)偶然。1979年，輝瑞公司投資開發(fā)出阿力甜，人工甜味劑進(jìn)入更為理性的研發(fā)時(shí)代，且甜度獲得更大幅度的提升。1993年紐特公司開發(fā)出紐甜，2008年日本味之素公司開發(fā)出愛德萬甜，甜度分別達(dá)到了蔗糖的8 000 倍和20 000 倍[8-9]。伴隨各類人工甜味劑的廣泛應(yīng)用，其在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等方面的安全性爭議不斷[10-12]，近期國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將阿斯巴甜列為“可能對(duì)人類致癌的物質(zhì)”，這一報(bào)道引起了人們對(duì)甜味劑安全性的廣泛關(guān)注。另一方面，環(huán)保主義和綠色消費(fèi)理念則驅(qū)動(dòng)著以糖苷類、糖醇類為代表的天然甜味劑快速發(fā)展。然而，天然甜味劑甜度相對(duì)偏低，又因原料產(chǎn)能限制導(dǎo)致生產(chǎn)成本相對(duì)較高，因此常與人工甜味劑搭配使用，改良產(chǎn)品風(fēng)味。目前，人工甜味劑市場占有率仍顯著高于天然甜味劑。

盡管現(xiàn)有甜味劑能夠提供類似于糖類的風(fēng)味感受和遠(yuǎn)高于糖類的甜味強(qiáng)度，但仍舊不能完全替代食用糖類所帶來的滿足感。研究發(fā)現(xiàn)，甜味劑的攝入可能會(huì)讓人更想吃含糖的甜食[13]，孕期攝入大量的甜味劑甚至?xí)?dǎo)致胎兒出生后對(duì)糖類食物產(chǎn)生更強(qiáng)烈的偏好，從而間接性地導(dǎo)致肥胖[14]。近二十年來，在動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)、大腦獎(jiǎng)賞系統(tǒng)活動(dòng)和關(guān)鍵神經(jīng)通路激活模式等不同層面的研究中均發(fā)現(xiàn)人類或動(dòng)物對(duì)糖類和甜味劑的行為偏好和腸-腦軸神經(jīng)反應(yīng)存在顯著差異，明確該現(xiàn)象及其深層生物學(xué)機(jī)制，對(duì)于完善甜味劑的功能評(píng)估體系和指導(dǎo)甜味劑的創(chuàng)新發(fā)展都具有十分重要的意義。本文綜述了糖類和甜味劑引發(fā)動(dòng)物行為偏好差異及其生物學(xué)機(jī)制方面的研究進(jìn)展；在此基礎(chǔ)上，從動(dòng)物行為學(xué)特征、腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)模式和關(guān)鍵受體激活能力3 個(gè)角度提出了完善當(dāng)前甜味劑功能評(píng)估體系的方法學(xué)建議，旨在為甜味劑的功能研究與創(chuàng)新發(fā)展提供參考。

1 糖類與甜味劑的腸-腦軸效應(yīng)差異研究

1.1 糖類與甜味劑引發(fā)的動(dòng)物行為偏好差異

大多數(shù)動(dòng)物都會(huì)被甜味吸引，然而面對(duì)糖類和甜味劑，動(dòng)物卻展現(xiàn)出明顯的選擇傾向性。在甜味受體發(fā)現(xiàn)之前，研究者認(rèn)為味覺系統(tǒng)可能是導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)糖類和甜味劑產(chǎn)生偏好差異的主要原因[15-16]。然而，在針對(duì)小鼠的味覺測試中發(fā)現(xiàn)，蔗糖和非糖類甜味成分（甘氨酸或L-絲氨酸）同時(shí)存在時(shí)小鼠表現(xiàn)出對(duì)蔗糖的明顯偏好[17]。48 h雙瓶偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)過程中小鼠消耗的葡萄糖比L-絲氨酸多[18]。在對(duì)蔗糖和三氯蔗糖的對(duì)比研究中也發(fā)現(xiàn)了小鼠對(duì)蔗糖的偏好，經(jīng)過饑餓訓(xùn)練的小鼠隨著時(shí)間推移，取食蔗糖的次數(shù)明顯增加[2]。雖然8%蔗糖溶液、0.3%甜菊糖苷溶液、10 mmol/L安賽蜜溶液、10 mmol/L三氯蔗糖溶液和10 mmol/L阿斯巴甜溶液均能引起小鼠明顯的甜味偏好，但是面對(duì)甜度相同的蔗糖和安賽蜜溶液時(shí)，相同時(shí)間內(nèi)小鼠對(duì)蔗糖的消耗量顯著高于安賽蜜[19]。這種對(duì)糖和甜味劑的顯著偏好差異在24 h內(nèi)即可出現(xiàn)，而48 h后小鼠幾乎只選擇糖溶液，從而出現(xiàn)完全的選擇傾向性[20]。

進(jìn)而有研究者推斷，這種對(duì)糖類和非糖類甜味物質(zhì)的行為偏好差異有可能來自不同成分與甜味受體結(jié)合能力的差異[17]。然而，甜味受體的發(fā)現(xiàn)以及甜味感知機(jī)制的相關(guān)研究成果推翻了這一假設(shè)[21-25]。人類感知甜味的能力由異源二聚體——味覺受體第一家族成員（taste receptor family 1 member，T1R）2/T1R3介導(dǎo)，敲除T1R3能夠去除小鼠感知甜味的能力[23,26-27]。Tan等[20]發(fā)現(xiàn)盡管T1R3敲除小鼠無法嘗到糖和安賽蜜的甜味，但它們卻依然能夠在糖和安賽蜜之間傾向性地選擇糖。分別將可引起野生小鼠最大偏好濃度的蔗糖、D-葡萄糖和3 種人工甜味劑（三氯蔗糖、安賽蜜和SC45647）溶液供給T1R3敲除小鼠時(shí)，48 h內(nèi)小鼠對(duì)各溶液的行為偏好均消失；進(jìn)一步將各溶液濃度提高到最大偏好濃度的5～10 倍時(shí)，T1R3敲除小鼠出現(xiàn)對(duì)蔗糖和D-葡萄糖的偏好，而對(duì)3 種人工甜味劑依然沒有產(chǎn)生偏好；此外，在胃內(nèi)輸注蔗糖的同時(shí)，通過口腔供給小鼠風(fēng)味溶液能使小鼠對(duì)風(fēng)味溶液產(chǎn)生偏好，而將蔗糖替換為三氯蔗糖后，偏好則不能產(chǎn)生[28]。

瞬時(shí)受體電位離子通道蛋白5（transient receptor potential melastatin 5，TRPM5）、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白（calcium homeostasis modulator，Calhm1）均是甜味信號(hào)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)元素，敲除TRPM5、Calhm1基因同樣可以阻斷甜味信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[29]。Zhang Yifeng等[30]發(fā)現(xiàn)敲除TRPM5小鼠對(duì)安賽蜜的偏好完全消失，而對(duì)于蔗糖和葡萄糖的舔舐次數(shù)雖有所降低，但仍然表現(xiàn)出行為偏好。類似的研究發(fā)現(xiàn)，TRPM5基因敲除小鼠保留了對(duì)蔗糖的偏好，但對(duì)三氯蔗糖的偏好消失[31]。Calhm1敲除小鼠每天消耗的蔗糖總量降低了一半，但依然形成了對(duì)蔗糖的偏好[32]。此外，以胃部灌注的方式對(duì)野生小鼠和TRPM5敲除小鼠分別進(jìn)行蔗糖或三氯蔗糖刺激后，小鼠均僅對(duì)蔗糖產(chǎn)生偏好[2]（圖1）。

圖1 糖和甜味劑的小鼠行為學(xué)差異Fig.1 Behavioral differences between sugars and sweeteners in mice

以上行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖類和甜味劑均可使正常小鼠產(chǎn)生甜味偏好，但是相比于甜味劑，小鼠更偏愛糖；敲除小鼠的甜味受體基因或甜味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因均能阻斷人工甜味劑誘發(fā)的行為偏好，但不能阻斷其對(duì)糖的行為偏好。這些現(xiàn)象說明糖類和甜味劑使小鼠產(chǎn)生偏好的機(jī)制并不完全相同，存在一種不需要甜味受體參與、獨(dú)立于味覺系統(tǒng)的神經(jīng)機(jī)制調(diào)控糖偏好的形成。

1.2 糖類與甜味劑引發(fā)的動(dòng)物腦區(qū)活動(dòng)差異

早先人們認(rèn)為腸道和大腦僅通過激素進(jìn)行信號(hào)傳遞，激素信號(hào)可以獨(dú)立于甜味感受刺激動(dòng)物對(duì)糖的消費(fèi)和偏好[33]。然而后來的研究表明，對(duì)膽囊收縮素A（小腸黏膜I細(xì)胞釋放的一種肽類激素）受體的藥理學(xué)抑制不會(huì)影響糖在胃內(nèi)輸注引發(fā)的偏好[34]。生長激素釋放肽也曾被認(rèn)為參與食物獎(jiǎng)賞的過程，而Sclafani等[35]研究發(fā)現(xiàn)，生長激素釋放肽受體敲除同樣不會(huì)影響小鼠對(duì)糖的偏好，進(jìn)而推翻了這一假設(shè)。

多項(xiàng)研究證明，大腦中DA釋放引發(fā)的獎(jiǎng)賞效應(yīng)參與了糖類攝入的中樞反應(yīng)[36-37]。在攝入糖后，能夠監(jiān)測到伏隔核區(qū)域DA的釋放[38-40]。DA受體（D1和D2型受體）的藥理學(xué)抑制也能抑制糖的攝入或消除胃內(nèi)輸注葡萄糖引發(fā)的條件性風(fēng)味偏好[41-46]。DA信號(hào)也參與調(diào)節(jié)糖或其他營養(yǎng)物質(zhì)如脂肪產(chǎn)生條件風(fēng)味偏好的能力[47-49]。因此，糖引起DA獎(jiǎng)賞環(huán)路響應(yīng)是糖偏好的重要研究切入點(diǎn)。隨著相關(guān)研究的深入，糖激活大腦釋放DA的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制逐漸明晰。Mark等[50]發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)輸注聚糖溶液可以誘發(fā)腹側(cè)紋狀體和背側(cè)紋狀體釋放DA?？诜湍c內(nèi)輸注蔗糖的研究結(jié)果均顯示出中腦邊緣系統(tǒng)和黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)神經(jīng)元活性的增加和DA的釋放[51]。研究表明，敲除TRPM5基因小鼠依然對(duì)胃內(nèi)注射D-葡萄糖產(chǎn)生了強(qiáng)烈的偏好，并且30 min內(nèi)檢測到腹側(cè)紋狀體和背側(cè)紋狀體DA釋放量增多；在胃部注射機(jī)體不可代謝的葡萄糖類似物同樣能檢測到DA的釋放（雖然釋放量有所降低），這種特異性偏好證明D-葡萄糖可以獨(dú)立于味覺系統(tǒng)和能量產(chǎn)生行為偏好，并具有刺激腹側(cè)紋狀體和背側(cè)紋狀體釋放DA的能力[52]。以上研究揭示了與糖信號(hào)有關(guān)的兩條DA釋放環(huán)路：第一條是中腦邊緣系統(tǒng)，從腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）投射到腹側(cè)紋狀體；第二條是黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，從黑質(zhì)致密部投射到背側(cè)紋狀體?？诜臀竷?nèi)輸注蔗糖溶液均可激活上述兩個(gè)環(huán)路神經(jīng)元，促進(jìn)DA釋放[53]。

Tellez等[3]針對(duì)糖信號(hào)引起DA釋放的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這兩條神經(jīng)環(huán)路在感知糖和甜味劑的反應(yīng)上存在差異：小鼠口腔攝入三氯蔗糖同時(shí)胃內(nèi)輸注三氯蔗糖或葡萄糖均可引起腹側(cè)紋狀體釋放DA，然而只有胃內(nèi)輸注葡萄糖時(shí)才能引起背側(cè)紋狀體釋放DA，這表明投射至背側(cè)紋狀體的DA神經(jīng)元對(duì)糖具有選擇敏感性；摻入苦味劑的三氯蔗糖溶液同時(shí)胃內(nèi)輸注葡萄糖能夠抑制腹側(cè)紋狀體釋放DA，而背側(cè)紋狀體仍有高水平的DA釋放量，這也間接說明了黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)可能負(fù)責(zé)對(duì)糖產(chǎn)生獎(jiǎng)賞反應(yīng)，而中腦邊緣系統(tǒng)可能負(fù)責(zé)對(duì)糖和甜味劑引發(fā)的甜味產(chǎn)生獎(jiǎng)賞反應(yīng)（圖2）。Fernandes等[2]利用深腦鈣成像技術(shù)監(jiān)測胃內(nèi)VTA多巴胺能神經(jīng)元的活性，與胃內(nèi)輸注三氯蔗糖相比，胃內(nèi)輸注蔗糖可以在1～2 min內(nèi)快速誘導(dǎo)VTA的DA神經(jīng)元出現(xiàn)持續(xù)正向上調(diào)活性，這說明蔗糖胃內(nèi)輸注引發(fā)的感覺信號(hào)從腸道到大腦的傳遞是十分迅速的，腸-腦之間可能存在一條“信息高速公路”支撐糖引發(fā)的感覺信號(hào)傳遞。

圖2 糖和甜味劑感知的多巴胺能獎(jiǎng)賞環(huán)路Fig.2 Dopaminergic reward circuits for sugar and sweetener perception

1.3 糖類與甜味劑引發(fā)的腸-腦軸神經(jīng)激活模式差異

Bohórquez等[54]通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的神經(jīng)纖維亞群時(shí)發(fā)現(xiàn)，一種特殊細(xì)胞亞群基部具有類似于神經(jīng)元軸突的胞質(zhì)突起，這些神經(jīng)纖維亞群既可以作為吸收營養(yǎng)的平臺(tái)，也可以作為分泌激素的啟動(dòng)平臺(tái)。這些腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為解釋腸道和大腦的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制開辟了新的研究路徑。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)分泌細(xì)胞與神經(jīng)元之間的突觸存在連接，這種突觸之間的信號(hào)傳遞可能比血液中的激素釋放信號(hào)更為直接，這些含有突起的腸道內(nèi)分泌細(xì)胞被稱為neuropod細(xì)胞；進(jìn)一步追蹤neuropod細(xì)胞的觸體發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞十分接近小腸和大腸的個(gè)別神經(jīng)纖維，同時(shí)60%的neuropod細(xì)胞會(huì)接觸感覺神經(jīng)元，因此，推測這些neuropod細(xì)胞可能參與了腸道感覺信號(hào)的傳遞；狂犬病病毒通常被用作神經(jīng)元單突觸連接的可視化工具，狂犬病病毒示蹤結(jié)果表明，結(jié)腸內(nèi)的neuropod細(xì)胞能夠被狂犬病毒成功感染，說明該病毒可以從腸道內(nèi)腔到達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)，因此neuropod細(xì)胞和腸道神經(jīng)元之間的確存在聯(lián)系[55]。Kaelberer等[56]對(duì)neuropod細(xì)胞進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞與迷走神經(jīng)元之間形成的突觸可以傳遞蔗糖或葡萄糖引發(fā)的信號(hào)：葡萄糖能夠誘發(fā)neuropod細(xì)胞釋放谷氨酸，并且可以引發(fā)迷走神經(jīng)元的興奮性突觸后電流；沉默neuropod細(xì)胞后，葡萄糖輸注誘導(dǎo)迷走神經(jīng)在幾毫秒內(nèi)的快速放電則被完全消除。這些研究結(jié)果表明，大腦在幾毫秒內(nèi)接受來自腸道輸入的糖刺激取決于neuropod細(xì)胞的谷氨酸能信號(hào)傳遞，然而這群細(xì)胞在糖偏好中的作用及機(jī)制至此仍未明確。

腸道中最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體是鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（sodium-glucose cotransporter 1，SGLT1），在腸上皮細(xì)胞和腸內(nèi)分泌表面均有表達(dá)。Kaelberer等[56]的研究證明SGLT1參與了葡萄糖或蔗糖刺激neuropod細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的過程，抑制SGLT1會(huì)阻斷谷氨酸的釋放，而SGLT1對(duì)葡萄糖具有選擇性，人工甜味劑并不能激活SGLT1。Tan等[20]從神經(jīng)元活動(dòng)的角度證明了SGLT1的激活能夠激活對(duì)葡萄糖攝入響應(yīng)的神經(jīng)元，抑制SGLT1能夠阻斷對(duì)葡萄糖攝入偏好的形成。這些研究表明糖類攝入信號(hào)的腸-腦軸信號(hào)傳遞需要SGLT1參與。

Buchanan等[57]基于neuropod細(xì)胞和SGLT1受體深入研究了糖和人工甜味劑的偏好行為：近端小腸注入蔗糖、葡萄糖類似物和人工甜味劑均會(huì)快速引發(fā)迷走神經(jīng)反應(yīng)，沉默neuropod細(xì)胞后迷走神經(jīng)反應(yīng)相應(yīng)消失，這表明3 類甜味物質(zhì)引發(fā)的迷走神經(jīng)反應(yīng)均依賴于neuropod細(xì)胞。阻斷SGLT1可消除蔗糖和葡萄糖類似物誘發(fā)的迷走神經(jīng)反應(yīng)，而阻斷T1R3僅能消除人工甜味劑誘發(fā)的迷走神經(jīng)反應(yīng)；利用活體雙光子成像和受體抑制實(shí)驗(yàn)確定了neuropod細(xì)胞分別通過釋放谷氨酸和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）兩種不同的神經(jīng)遞質(zhì)將蔗糖和人工甜味劑的腸道刺激傳遞到迷走神經(jīng)的不同神經(jīng)元亞群；分別提供給小鼠含有三氯蔗糖溶液和同等甜度的蔗糖溶液，小鼠表現(xiàn)出對(duì)蔗糖的偏好，抑制neuropod細(xì)胞或谷氨酸受體均會(huì)導(dǎo)致小鼠對(duì)蔗糖的偏好消失。以上研究表明，小鼠的糖偏好取決于neuropod細(xì)胞，neuropod細(xì)胞分別依賴SGLT1和甜味受體T1R3分辨出糖和人工甜味劑信號(hào)。糖類和人工甜味劑會(huì)刺激neuropod細(xì)胞分別釋放谷氨酸和ATP作為神經(jīng)遞質(zhì)，通過釋放不同的神經(jīng)遞質(zhì)激活迷走神經(jīng)的不同神經(jīng)元亞群，進(jìn)而讓大腦分辨糖和人工甜味劑。

孤束尾核（caudal portion of solitary tract nucleus，cNTS）是機(jī)體內(nèi)部感知信號(hào)向大腦傳遞的中繼器。研究表明，不同的cNTS神經(jīng)元亞群可被十二指腸或胃內(nèi)的葡萄糖或甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷激活，而糖精則無法激活cNTS[58-59]。利用腺病毒攜帶的破傷風(fēng)毒素阻斷被糖激活的cNTS神經(jīng)元突觸傳遞功能后，小鼠對(duì)于糖的偏好消失，因此可以認(rèn)為cNTS是小鼠對(duì)葡萄糖產(chǎn)生偏好的重要中繼。切斷雙側(cè)迷走神經(jīng)可阻斷cNTS神經(jīng)元被激活，這表明糖攝入信號(hào)的傳遞需要通過迷走神經(jīng)，進(jìn)而通過迷走神經(jīng)結(jié)狀神經(jīng)元傳遞信號(hào)并激活cNTS神經(jīng)元[20]。

至此，糖類攝入信號(hào)在腸-腦軸傳遞的神經(jīng)通路基本明晰，口腔攝入的糖類和甜味劑均能激活位于口腔的甜味受體細(xì)胞，將信息傳遞至中腦邊緣DA系統(tǒng)刺激腹側(cè)紋狀體DA的釋放。但進(jìn)入胃和近端小腸（十二指腸）后，糖類和人工甜味劑則出現(xiàn)了明顯差異。蔗糖或葡萄糖等能夠與腸道內(nèi)neuropod細(xì)胞表面SGLT1受體結(jié)合，neuropod細(xì)胞軸突釋放谷氨酸激活迷走神經(jīng)，迷走神經(jīng)的結(jié)狀神經(jīng)元亞群通過單突觸繼續(xù)將糖攝入的信息傳遞到腦干cNTS神經(jīng)元，進(jìn)一步激活黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)背側(cè)紋狀體DA的釋放。而人工甜味劑則與neuropod細(xì)胞表面的甜味受體T1R3結(jié)合，使neuropod細(xì)胞軸突釋放神經(jīng)遞質(zhì)ATP將信息傳遞到迷走神經(jīng)，但并不引發(fā)腦干cNTS神經(jīng)元的響應(yīng)（圖3）。因此，大腦可以辨別糖和甜味劑從而使個(gè)體表現(xiàn)出行為偏好的差異。

圖3 腸道neuropod細(xì)胞識(shí)別糖和甜味劑的分子機(jī)制[53]Fig.3 Molecular mechanisms of discrimination between sugars and sweeteners by gut neuropod cells[53]

2 基于腸腦軸效應(yīng)的甜味劑功能評(píng)估和創(chuàng)新研發(fā)的新方法

甜味劑和糖類的腸-腦軸效應(yīng)差異是決定甜味劑能否產(chǎn)生長時(shí)程行為偏好的根本原因，這對(duì)于甜味劑的功能評(píng)估和創(chuàng)新研發(fā)意義重大。目前對(duì)是否所有的甜味劑都不能引發(fā)腸-腦軸效應(yīng)尚未明確，同時(shí)新一代甜味劑研發(fā)更應(yīng)該將引發(fā)腸-腦軸效應(yīng)作為重要功能指標(biāo)。因此，本文從3 個(gè)層面分別總結(jié)了甜味成分腸-腦軸效應(yīng)相關(guān)的研究手段，提出了3 種可用于甜味劑腸-腦軸效應(yīng)評(píng)估的方式，旨在為相關(guān)產(chǎn)業(yè)界開展甜味劑創(chuàng)新研發(fā)提供參考。

2.1 利用動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)的評(píng)估方式

行為學(xué)方法能夠簡便且直觀地表征動(dòng)物行為偏好。雙瓶偏好實(shí)驗(yàn)是行為學(xué)研究中面對(duì)類似問題最常用的實(shí)驗(yàn)手段。例如利用野生小鼠、T1R3或TRPM5等基因敲除小鼠模型，并使用小鼠糖水偏好裝置，通過監(jiān)控相同時(shí)間內(nèi)小鼠對(duì)含甜味劑溶液和糖溶液的消耗量或計(jì)算動(dòng)物偏好指數(shù)（分析前100 次和后100 次動(dòng)物舔舐甜味劑占總舔舐次數(shù)的百分比），即可有效量化小鼠對(duì)甜味劑的行為偏好。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可以設(shè)計(jì)兩種實(shí)施策略：一種是以野生小鼠為動(dòng)物模型，監(jiān)測野生小鼠在葡萄糖和甜味劑之間的偏好選擇，如果小鼠在葡萄糖和甜味劑之間沒有行為偏好，則反映甜味劑和葡萄糖同樣具有激活腸-腦軸的能力（圖4）。另一種是以T1R3或TRPM5等基因敲除小鼠為動(dòng)物模型，監(jiān)測小鼠在水和甜味劑之間的偏好選擇。T1R3和TRPM5基因的敲除分別阻斷了甜味感知和甜味信號(hào)傳導(dǎo)的通路，小鼠依然能夠形成對(duì)糖的偏好。因此，如果基因敲除小鼠形成了對(duì)甜味劑的偏好，即可反映該甜味劑具有激活腸-腦軸的能力。

圖4 雙瓶偏好實(shí)驗(yàn)[18]Fig.4 Two-bottle preference experiment[18]

結(jié)合野生小鼠、T1R3敲除小鼠或TRPM5敲除小鼠等動(dòng)物模型，利用雙瓶偏好等行為學(xué)研究方法，能夠從功能層面有效評(píng)估新型甜味劑激活腸-腦軸的能力。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)具有設(shè)備要求低、實(shí)驗(yàn)操作簡單、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢(shì)，是一種低成本高效率的甜味劑腸-腦軸激活能力評(píng)估方式。

2.2 利用腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)檢測的評(píng)估方式

糖類可通過腸-腦軸激活中腦邊緣系統(tǒng)和黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)釋放DA產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)；而人工甜味劑如三氯蔗糖等僅能通過口腔甜味受體激活中腦邊緣系統(tǒng)產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)。因此，可以通過黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的激活或DA的釋放特征評(píng)估甜味劑是否具有激活腸-腦軸的能力。目前針對(duì)DA獎(jiǎng)賞環(huán)路的研究較多，技術(shù)路線已經(jīng)較為成熟。

DA神經(jīng)元激活的研究方法常以DA受體標(biāo)記（DATCre）的轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型，結(jié)合立體定位儀和微量注射裝置將能表征神經(jīng)元活動(dòng)的鈣熒光指示劑注射到黑質(zhì)致密部，將鈣熒光蛋白特異性地表達(dá)在黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元上，利用光纖記錄或雙光子鈣成像等技術(shù)手段監(jiān)控胃內(nèi)輸注甜味劑后多巴胺能神經(jīng)元（群體神經(jīng)元或單個(gè)神經(jīng)元）熒光強(qiáng)度的變化規(guī)律，從而反映甜味劑激活腸-腦軸的能力（圖5）。通過cNTS神經(jīng)元的激活也可以表征甜味劑是否具有激活腸-腦軸的能力，但孤束核位于腦干，相比于黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作難度較大。

圖5 以DAT-Cre小鼠為動(dòng)物模型利用光纖記錄甜味劑胃內(nèi)輸注后DA神經(jīng)元的活性[2]Fig.5 DAT-Cre mice as an animal model for fiber optic recording of DA neuron activity after intragastric infusion of sweeteners[2]

通過檢測黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)背側(cè)紋狀體區(qū)域DA的釋放是獎(jiǎng)賞環(huán)路研究另一個(gè)可選擇的技術(shù)。以C57BL/6小鼠（實(shí)驗(yàn)室最常用的小鼠品系）為動(dòng)物模型，將監(jiān)測神經(jīng)遞質(zhì)釋放的DA探針表達(dá)在背側(cè)紋狀體神經(jīng)元上，利用光纖記錄手段，監(jiān)控胃內(nèi)輸注甜味劑后代表性神經(jīng)遞質(zhì)DA釋放熒光強(qiáng)度的變化規(guī)律，進(jìn)而反映甜味劑激活腸-腦軸的能力。

與行為學(xué)評(píng)估方法相比，利用腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)的評(píng)估方法能夠更為直觀地觀察到腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)，更加客觀地量化評(píng)價(jià)新型甜味劑腸-腦軸激活能力。但是，這些方法涉及到動(dòng)物手術(shù)和腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)監(jiān)控技術(shù)，對(duì)其及設(shè)備要求相對(duì)較高；同時(shí)，所使用的生物探針表達(dá)時(shí)間周期較長，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間成本也相對(duì)較高。

2.3 利用關(guān)鍵受體激活能力的評(píng)估方式

SGLT1受體是糖類腸-腦軸信號(hào)產(chǎn)生的關(guān)鍵靶點(diǎn)，葡萄糖是SGLT1受體的特異性配體。葡萄糖通過與細(xì)胞表面的SGLT1受體結(jié)合可以引發(fā)胞內(nèi)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞活性的增加，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度增高。近年來，受體蛋白的高效異源表達(dá)技術(shù)取得了巨大進(jìn)步。異源表達(dá)細(xì)胞系統(tǒng)可以是人胚胎腎細(xì)胞（HEK-293）、幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK）、綠猴腎細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）等[60-62]。當(dāng)前已有研究成功構(gòu)建了人胚胎腎細(xì)胞（HEK-293）SGLT家族中SGLT2基因異源表達(dá)體系[63]。因此，可以通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建SGLT1蛋白基因真核表達(dá)載體，向異源細(xì)胞系統(tǒng)插入表達(dá)SGLT1蛋白的基因，使細(xì)胞單一地表達(dá)SGLT1受體蛋白。進(jìn)一步運(yùn)用鈣離子成像技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，給予甜味劑刺激后通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞熒光變化，從而評(píng)估甜味劑對(duì)SGLT1的激活能力。

此外，腸道neuropod細(xì)胞表達(dá)SGLT1蛋白，葡萄糖可特異性地結(jié)合SGLT1蛋白激活neuropod細(xì)胞釋放谷氨酸[55,64]。因此可以通過甜味劑是否激活neuropod細(xì)胞釋放谷氨酸評(píng)估甜味劑激活腸-腦軸的能力。例如將表達(dá)谷氨酸熒光探針（iGluSnFR）的細(xì)胞（如HEK-293、BHK細(xì)胞等）和neuropod細(xì)胞共培養(yǎng)后加入甜味劑，利用激光掃描共聚焦顯微鏡可以實(shí)時(shí)觀察表達(dá)iGluSnFR細(xì)胞的熒光變化，以量化反映谷氨酸的釋放情況，從而判斷甜味劑是否具有激活腸-腦軸的能力（圖6）。

圖6 Neuropod細(xì)胞和表達(dá)谷氨酸熒光探針細(xì)胞共培養(yǎng)[55]Fig.6 The co-culture of neuropod cells and cells expressing iGluSnFR[55]

測定關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白激活能力能從更深層的角度（受體、分子）評(píng)估甜味劑激活腸-腦軸的能力，所涉及技術(shù)方法依賴于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的異源SGLT1受體蛋白細(xì)胞株或從動(dòng)物的腸道分離出neuropod細(xì)胞。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)環(huán)境需要細(xì)胞培養(yǎng)間，并配備熒光共聚焦顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)箱等一系列設(shè)備，同時(shí)要求實(shí)驗(yàn)人員具備專業(yè)的分子生物學(xué)技術(shù)背景和儀器操作技能。

3 結(jié)語

本文系統(tǒng)梳理了糖類與甜味劑引發(fā)的動(dòng)物行為偏好差異、動(dòng)物腦區(qū)活動(dòng)差異和腸-腦軸神經(jīng)激活模式差異3 個(gè)方面的研究進(jìn)展，闡釋了大腦可以辨別糖和甜味劑使個(gè)體表現(xiàn)出行為偏好差異的根本原因?；谀c-腦軸效應(yīng)的宏觀表現(xiàn)和內(nèi)在機(jī)制，提出了利用動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)、腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)和關(guān)鍵受體激活能力3 種技術(shù)手段完善甜味劑功能評(píng)估體系的建議。關(guān)注甜味劑的腸-腦軸效應(yīng)對(duì)于該領(lǐng)域的創(chuàng)新發(fā)展意義重大。