張雲(yún)杰，謝甦，趙大尉，關(guān)惠婷，胡雅清，張晨宇，賀昀

（1.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004；3.天津市失智老人康復照料中心，天津 300131；4. 廣東省珠海市第二中醫(yī)院，廣東 珠海 519100）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與轉(zhuǎn)歸嚴重影響女性的日常生活。化療作為乳腺癌全身治療中的重要一環(huán)被廣泛應用于臨床，但是在殺傷腫瘤的同時，對高度致敏的T細胞也有殺傷作用，并造成患者免疫力下降。前期研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷丸可改善乳腺癌患者化療期間的不良反應，提高免疫功能[1-2]。因此本實驗進一步深入探索，通過復制4T1乳腺癌小鼠模型，以單純化療、化療聯(lián)合中藥為干預手段，檢測小鼠脾臟中 CD4＋、CD8＋、CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell, Treg）的表達水平，從薯蕷丸對化療4T1乳腺癌小鼠T細胞亞群的影響，評價薯蕷丸對化療后乳腺癌小鼠免疫功能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物 SPF級BALB/c雌性6周齡小鼠32只，體重（20±2）g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)批號：SCKK（黔）2015-0001，由貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床實驗中心提供SPF級動物房。

1.1.2 實驗細胞 4T1小鼠乳腺癌細胞株由中國科學院上海細胞庫提供。

1.1.3 實驗藥品 ①薯蕷丸（中藥），具體配方：大棗30 g，白蘞、干姜各3 g，防風、茯苓、生曬參、桔梗、杏仁、白術(shù)、芍藥、麥門冬各5 g，大豆卷、柴胡、川芎、桂枝、阿膠各6 g，神曲、干地黃、當歸各10 g，甘草18 g、薯蕷20 g，由北京同仁堂貴陽分店提供。按質(zhì)量標準制成流浸膏于4℃冰箱存儲。②多西他賽（化療藥物）由江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（生產(chǎn)批號：20150101），貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院提供。

1.1.4 實驗試劑 培養(yǎng)基（型號：RPMI 1640）、胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS）購自北京索萊寶公司，F(xiàn)oxp3/Transcription Factor、Staining Buffer Set Kit試劑盒（美國eBioscience公司）。

1.1.5 實驗儀器 EPICL XL型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），PM-10AD光學顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 隨機將32只BALB/C雌性小鼠分為對照組、模型組、化療組、中藥組，各組8只。

1.2.2 4T1乳腺癌小鼠模型的復制 將4T1細胞株與完全培養(yǎng)基混懸（含90% RPMI 1640＋10%胎牛血清）后，置于5% CO2二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱中，待細胞生長至80%～90%予以傳代。取對數(shù)期的4T1乳腺癌細胞，使用臺盼藍拒染法檢測細胞活力＞95%后，制備細胞濃度為1×107個/ml的細胞懸液。模型組小鼠左側(cè)腹部注射0.1 ml細胞懸液，同時對照組小鼠左側(cè)腹部注射0.1 ml生理鹽水。約1周后即可形成約5 mm×5 mm腫塊，取部分腫塊組織進行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining, HE）染色，鏡下觀察是否為腫瘤細胞。

1.2.3 實驗動物給藥 成瘤后第1天，中藥組、化療組小鼠按6.28 mg/kg的標準腹腔注射多西他賽（用注射用生理鹽水定容至0.1 ml），1次/7 d，持續(xù)21 d[3]；模型組、對照組小鼠腹腔注射0.1 ml生理鹽水，1次/7 d，持續(xù)21 d。首次注射化療藥物的次日，中藥組給予0.3 ml薯蕷丸湯劑灌胃，其他組予以0.3 ml生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)21 d。

1.2.4 實驗動物處死及組織取樣 治療完成后當晚小鼠禁食、未禁飲1 d。第2天將小鼠置于超凈工作臺頸椎脫臼處死，用無菌術(shù)器械取出小鼠脾臟，迅速置于3 ml緩沖液（PBS和1%胎牛血清混合液）中，于60 mm培養(yǎng)皿中輕研脾臟，研磨完畢后移去細胞篩，將混合液移入15 ml離心管中，置于冰上，配平后4℃、1 500 r/min離心5 min，去上清液。每管中加入1ml紅細胞裂解液，靜置5 min，加緩沖液至15 ml，4℃、1 500 r/min離心5 min，去上清液。加入1000μl緩沖液混懸，分為2管，各100μl，標記為A、B，每管1×105～1×108個細胞，備用。

1.2.5 流式細胞術(shù) 將CD4、CD8、CD25細胞表面分子進行染色，固定、破膜后染色細胞內(nèi)Foxp3分子。每列樣本均設(shè)A、B管，分別吸取收集好的淋巴細胞懸液100μl放入A、B管，每管分別加入0.500μl CD4 FITC、2.500μl CD8 PerCP、0.625μl CD25 APC，室溫靜置20 min，加入冷PBS 2ml混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。在A、B管中分別加入配好的固定液1 ml，邊加邊混勻，室溫靜置30 min。不需潤洗，每管加入2 ml配好的緩沖液，1 500 r/min，5 min，棄上清。每管加入100μl緩沖液混懸，分別加入1.25μl Fox P3PE單抗及同型對照，室溫靜置20 min，加入2 ml緩沖液潤洗后，1 500 r/min，5 min，棄上清。每管用500μl緩沖液混懸細胞，吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織病理切片結(jié)果

大部分癌細胞為橢圓形或圓形，核漿比率較大，染色質(zhì)、核仁染色較深，細胞分裂活躍，細胞排列無序，分化程度低。癌細胞表現(xiàn)為彌漫性片狀實性分布，一小部分呈腺腔樣，且浸入橫紋肌及周圍組織，伴部分壞死。說明所取組織為癌變組織，提示模型復制成功。見圖1。

2.2 各組小鼠脾臟中 CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋水平比較

2.2.1 CD4＋4組小鼠脾臟中CD4＋細胞表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組CD4＋表達量較對照組降低（P＜0.05），化療組和中藥組CD4＋表達量較模型組降低（P＜0.05），中藥組CD4＋表達量較化療組升高（P＜0.05）。見附表和圖2。

圖1 小鼠乳腺癌組織切片圖 （HE×200）

2.2.2 CD8＋4組小鼠脾臟中CD8＋細胞表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組CD8＋表達量較對照組降低（P＜0.05），化療組和中藥組CD8＋表達量較模型組降低（P＜0.05），但是化療組與中藥組CD8＋細胞表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見附表和圖3。

2.2.3 CD4＋/CD8＋4組小鼠脾臟中 CD4＋/CD8＋水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組CD4＋/CD8＋比值較對照組降低（P＜0.05），化療組和中藥組CD4＋/CD8＋比值較模型組升高（P＜0.05），中藥組 CD4＋/CD8＋比值較化療組升高（P＜0.05）。見附表和圖 2、3。

2.3 各組小鼠脾臟中 CD4＋ CD25＋ Foxp3＋ Treg細胞水平比較

對照組、模型組、化療組、中藥組小鼠脾臟 中 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 表 達 水 平 分 別 為（6.28±1.54）%、（16.72±3.41）%、（12.77±1.30）%和（9.65±1.41）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=18.472，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg表達量較對照組升高（P＜0.05），化療組和中藥組 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg表達量較模型組降低（P＜0.05），中藥組 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg表達量較化療組升高（P＜0.05）。見圖 4。

附表 各組小鼠脾臟中CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋水平比較 （n =8，%，±s）

附表 各組小鼠脾臟中CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋水平比較 （n =8，%，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05；3）與化療組比較，P ＜0.05

組別 CD4＋ CD8＋ CD4＋/CD8＋對照組 24.69±3.74 13.36±1.60 1.85±0.19模型組 14.60±1.211） 12.19±0.791） 1.20±0.101）化療組 10.56±1.121）2） 7.64±0.461）2） 1.39±0.181）2）中藥組 12.49±0.291）2）3） 7.95±1.081）2） 1.59±0.211）2）3）F值 75.572 59.689 20.08 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 各組小鼠脾臟中CD4＋細胞表達水平

圖3 各組小鼠脾臟中CD8＋細胞表達水平

圖4 各組小鼠脾臟中CD4＋ CD25＋ Foxp3＋ Treg細胞含量

3 討論

乳腺癌是一種嚴重影響女性身心健康，甚至危及生命的惡性腫瘤，是女性癌癥死亡的首要原因。當前乳腺癌的治療以手術(shù)為主，有序結(jié)合放化療、內(nèi)分泌治療等方式進行綜合治療。其中化療是最為有效和不可或缺的全身治療手段之一，可以殺死腫瘤細胞，為乳腺癌進一步治療提供前提條件，同時化療也影響正常細胞，抑制細胞免疫功能，降低免疫力。

現(xiàn)代研究認為，機體免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。細胞免疫是機體對抗腫瘤免疫的基本途徑，其中T淋巴細胞是機體調(diào)節(jié)免疫反應中最主要的效應細胞，由功能各異的淋巴細胞亞群來發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，以CD4＋和CD8＋最為重要。CD4＋為輔助（Th）/誘導T細胞，可以輔助細胞免疫反應，通過抗原提呈細胞識別腫瘤細胞分泌的可溶性抗原，參與激活巨噬細胞分泌的IFN-γ或者激活NK細胞，促進抗體形成，B細胞的活化，并將各類免疫細胞聚集到腫瘤周圍，殺傷MHCⅡ類抗原陰性腫瘤細胞，發(fā)揮抗腫瘤的作用。CD8＋T細胞主要為抑制T細胞（suppressor T cell, TS）和細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell, CTL）。TS細胞直接阻斷腫瘤細胞與淋巴細胞表面相對應的受體的結(jié)合，削弱機體對腫瘤細胞的免疫反應，同時TS細胞還可分泌一些免疫抑制因子，實現(xiàn)對機體免疫反應的抑制作用。與TS細胞不同，CTL是機體抵抗腫瘤細胞、病毒感染的重要效應細胞，能夠利用不同渠道對腫瘤細胞產(chǎn)生影響，比如分泌能介導細胞溶解或凋亡的TNF-α、IFN-γ等細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤周圍不僅浸潤大量的CD4＋、CD8＋T細胞，還浸潤大量的 Treg細胞，主要為 CD4＋CD25＋Treg細胞[4-7]。CD4＋CD25＋Treg細胞是一群具有免疫無能、免疫抑制及免疫調(diào)節(jié)等特點的T細胞亞群，通過發(fā)揮免疫抑制作用和調(diào)節(jié)其他免疫細胞來維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[8-10]。CD4＋CD25＋Treg細胞的特異性標志物為雙叉頭狀的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，其能為CD4＋CD25＋Treg細胞的發(fā)育和免疫抑制功能提供重要條件，不僅是CD4＋CD25＋Treg細胞發(fā)育的一個重要開關(guān)，也是介導CD4＋CD25＋Treg細胞免疫抑制功能的關(guān)鍵因素[11-12]，可通過某種途徑調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移。

在免疫功能正常的人群中，CD4＋/CD8＋比值處于一種動態(tài)平衡[13-14]，CD4＋CD25＋Treg細胞亦相對穩(wěn)定，各自發(fā)揮作用。一旦患者罹患惡性腫瘤，這些動態(tài)平衡都將發(fā)生改變，具體表現(xiàn)為CD4＋細胞的減少，CD8＋細胞略升高、正常或略降低（由Ts細胞相對增加，CTL細胞相對減少造成），CD4＋CD25＋Treg細胞增多，這些改變促使機體監(jiān)視腫瘤細胞功能下降，引起腫瘤細胞的生長、逃逸與轉(zhuǎn)移[15]。有研究表明，CD4＋/CD8＋比值下降將降低患者遠期生存率，Treg細胞升高可以引起腫瘤細胞的逃逸與轉(zhuǎn)移，因此本實驗選用這幾個指標觀察薯蕷丸對乳腺癌小鼠化療后免疫功能的影響。4T1乳腺癌小鼠模型復制成功后，免疫功能下降，化療后加劇了該狀態(tài)，而薯蕷丸能有效提高小鼠的免疫功能；化療組和中藥組CD8＋水平無明顯下降趨勢，可能與CD8＋細胞分類有關(guān)。4T1乳腺癌小鼠模型復制成功后，脾臟中CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg細胞表達水平升高，增加了腫瘤細胞逃逸的可能性；化療的全細胞毒性作用降低了CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg細胞表達水平，減少腫瘤細胞逃逸的可能性，化療聯(lián)合中藥治療對CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg細胞作用效果更優(yōu)。

中醫(yī)學將乳腺癌歸為“乳巖、乳癖”范疇，提出“正氣虛為巖”，認為正氣不足，氣血虧虛，臟腑功能失調(diào)是乳巖發(fā)生的前提和決定因素，有形之邪盤踞于體內(nèi)，耗傷氣血，瘀阻經(jīng)絡(luò)，日久則氣血陰陽俱虛，屬本虛標實之證?；煘榛馃崴幎局?，加重了其本虛標實的證候，因此正氣不足、氣血虧虛、虛實夾雜、易感外邪這一病因、病機始終貫穿在乳腺癌化療患者的病程中。薯蕷丸是仲景扶正祛邪，治療虛勞性疾病的名方，主治“虛勞諸不足，風氣百疾”，與乳腺癌病機極為相似，故臨床上可選用薯蕷丸為乳腺癌化療期間的基礎(chǔ)方。薯蕷丸以薯蕷為君藥，薯蕷之性不寒不熱，能健脾養(yǎng)胃，使脾胃健運，氣血生化有源；人參、白術(shù)、茯苓、甘草益氣健脾；干姜、大棗甘溫扶脾陽；當歸、川芎、芍藥、熟地養(yǎng)血和血，與大棗相合共治血虛；阿膠、麥冬滋陰；用桂枝可去太陽之邪，柴胡去少陽之邪，防風去陽明之邪，余邪可散；神曲消食健脾，以消食積；桔梗合柴胡使氣機升，白蘞和杏仁使氣機降，則氣機之升降出入可恢復。諸藥配伍，補中寓散，補虛而不斂邪，祛邪不傷正。在前期臨床實驗中，發(fā)現(xiàn)薯蕷丸可在一定程度上緩解化療后乳腺癌患者的臨床癥狀，改善骨髓抑制，提高免疫功能[1-2]。

綜上所述，薯蕷丸可以提高化療4T1乳腺癌小鼠CD4＋、CD4＋/CD8＋細胞表達水平，降低 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg細胞表達水平，改善化療后乳腺癌小鼠免疫功能。