金萬虎，張平，金鐵峰，李春國

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 婦科，吉林 延吉133000；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 疼痛科，吉林延吉133000；3.延邊大學(xué) 腫瘤研究中心，吉林 延吉133000；4.吉林省吉林市中心醫(yī)院 腫瘤科，吉林 吉林 132011）

宮頸癌是我國女性腫瘤發(fā)病率第2位的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐年升高[1-2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是腫瘤在侵襲、浸潤過程中的重要功能及形態(tài)學(xué)改變。有研究證實，宮頸癌常以EMT的形式發(fā)生間質(zhì)浸潤并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3-4]。有研究表明，PI3K和mTOR雙重靶向抑制劑BEZ235及EMT靶向抑制劑AZD6244具有一定的抗腫瘤作用[5-6]。但用藥過程中出現(xiàn)的毒副作用嚴(yán)重制約其療效，且兩藥合用是否具有協(xié)同作用研究較少，故實驗通過聯(lián)合應(yīng)用BEZ235、AZD6244，探討其抑制人宮頸癌的作用機(jī)制，為小分子靶向治療藥物治療宮頸癌提供有效的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌Hela和SiHa細(xì)胞株常規(guī)凍存于延邊大學(xué)腫瘤研究中心，胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）等化學(xué)試劑購自北京華美公司，Western blot檢測相關(guān)試劑、MTT試劑購自武漢博士德生物有限公司，EMT標(biāo)志物蛋白E-cadherin、ZO-1、Vimentin及Snail抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 MTT比色法

采用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖能力。將宮頸癌細(xì)胞株Hela（腺癌）及SiHa（鱗癌）接種于含10%胎牛血清、5%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%二氧化碳CO2常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化并傳代。將處于對數(shù)生長期的Hela和SiHa細(xì)胞按2×103個/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度為 0.0、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0和100.0 nmol/L的 BEZ235和 1、3、10、30、100、300和1 000 nmol/L的AZD6244，每種濃度分別設(shè)3個平行復(fù)孔，對照組加入等體積的培養(yǎng)液。72 h后加入50μl/孔MTT，反應(yīng)4 h后棄上清，加入200μl/孔DMSO，輕輕震蕩數(shù)分鐘，應(yīng)用瑞士Tecan公司生產(chǎn)的全波長多功能酶標(biāo)儀（型號Infinite 200 PRO），在570 nm波長處測定其吸光值，并按公式計算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率（%）=實驗組吸光值／對照組吸光值×100%。

1.3 劃痕愈合實驗

采用劃痕愈合實驗檢測細(xì)胞遷移能力。將密度為5×105個/ml的Hela和SiHa細(xì)胞接種于6孔板中，2 ml/孔，孵育24 h。待細(xì)胞完全貼壁，用10μl移液槍槍頭在單層細(xì)胞上劃一條直線，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3次，分別加入普通培養(yǎng)基、含BEZ235的培養(yǎng)液、含AZD6244的培養(yǎng)液，以及同時含AZD6244、BEZ235的培養(yǎng)液，24 h后觀察并拍照。

1.4 Western blot檢測

Hela和 SiHa細(xì) 胞 經(jīng) BEZ235、AZD6244， 以及BEZ235聯(lián)合AZD6244作用24 h，用PBS洗2次后提取總蛋白。采用Bradford法測定蛋白濃度，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行蛋白分離，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。室溫下?lián)u床封閉（TBST+5%脫脂奶粉）2 h，加入兔抗人E-cadherin、Vimentin和β-actin的單克隆抗體，4℃過夜。室溫下洗膜，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔IgG二抗，孵育2 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光，觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BEZ235聯(lián)合AZD6244抑制Hela和SiHa細(xì)胞增殖

BEZ235、AZD6244單獨或聯(lián)合應(yīng)用處理細(xì)胞72 h。MTT結(jié)果顯示，BEZ235對Hela和SiHa細(xì)胞的半數(shù)抑制率（half maximal inhibitory concentration, IC50）分 別 為 19.41和 62.51 nmol/L。AZD6244對 Hela和SiHa細(xì)胞的IC50分別為302.31和511.04 nmol/L（見圖1）。兩藥聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同抑制Hela和SiHa細(xì)胞增殖，聯(lián)合用藥指數(shù)（combination index, CI）分別為0.51和0.64，具有較好的協(xié)同抑制效果（見圖2）。

2.2 BEZ235聯(lián)合AZD6244對Hela細(xì)胞遷移能力的影響

MTT結(jié)果顯示，BEZ235聯(lián)合AZD6244對Hela細(xì)胞的協(xié)同作用更明顯（CIHela＜CISiHa）。筆者在體外培養(yǎng)的Hela單層細(xì)胞上劃痕致傷，分別以半數(shù)抑制率濃度的BEZ235（20 nmol/L）和AZD6244（300 nmol/L）聯(lián)合作用48 h。對照組、BEZ235組、AZD62444組、聯(lián)合用藥組的細(xì)胞遷移率分別為（83.88±1.48）%、（65.52±3.46）%、（75.50±3.72）% 和（50.82±1.95）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=76.289，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，聯(lián)合用藥組比對照組、BEZ235組、AZD62444組抑制Hela細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)（P＜0.05）。見圖3、4。

圖1 BEZ235、AZD6244抑制Hela和SiHa細(xì)胞增殖 （±s）

圖2 BEZ235聯(lián)合AZD6244協(xié)同抑制Hela和SiHa細(xì)胞增殖 （±s）

圖3 BEZ235、AZD6244協(xié)同抑制Hela細(xì)胞遷移

圖4 各組Hela細(xì)胞遷移率比較 （±s）

2.3 BEZ235、AZD6244對EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

20 nmol/L BEZ235和300 nmol/L AZD6244分別單獨或聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞48 h后，與單獨用藥組及未加藥對照組比較，宮頸癌細(xì)胞由三角形或多角形變?yōu)殚L梭形。對照組、BEZ235組、AZD62444組、聯(lián)合用藥組的E-cadherin蛋白相對表達(dá)量分別為（22.04±0.58）、（98.42±3.86）、（51.33±5.22）、和（33.61±3.67），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.164，P=0.012）；對照組、BEZ235組、AZD62444組、聯(lián)合用藥組的ZO-1蛋白相對表達(dá)量分別為（38.86±3.08）、（28.44±1.12）、（39.93±5.23）和（58.10±3.26），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.311，P=0.000）；對照組、BEZ235組、AZD62444組、聯(lián)合用藥組的Vimentin蛋白相對表達(dá)量分別為（28.60±1.33）、（21.05±0.88）、（30.67±1.64）和（10.15±1.08），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.051，P=0.006）；對照組、BEZ235組、AZD62444組、聯(lián)合用藥組的Snail蛋白相對表達(dá)量分別 為（10.63±0.96）、（6.32±0.43）、（5.2±0.88） 和（1.22±0.12），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=94.783，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，聯(lián)合用藥組較BEZ235組E-cadherin、ZO-1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Snail、Vimentin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組較 AZD6244組E-cadherin、ZO-1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Snail、Vimentin 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組相對于BEZ235組、AZD6244組抑制EMT的能力更強(qiáng)。見圖5、6。

圖5 各組EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)

圖6 BEZ235與AZD6244協(xié)同抑制Hela細(xì)胞EMT形成 （±s）

3 討論

癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌預(yù)后差，難以治愈的重要因素[7]。PI3K-Akt和EMT-ERK信號通路是EGFR下游經(jīng)典信號通路，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起到非常重要的作用。PI3K-Akt和EMT-ERK信號通路被激活后，產(chǎn)生一系列的連鎖反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖能力、血管新生能力、炎癥反應(yīng)等均得到增強(qiáng)。因此，通過抑制PI3K信號通路的活性，從而達(dá)到攻克腫瘤的目的一直是腫瘤研究領(lǐng)域的重量級課題[8-9]。大量研究證實，單獨阻斷PI3K/Akt或EMT/ERK信號通路雖然可以部分抑制腫瘤生長，但是腫瘤細(xì)胞仍可以通過其他信號通路途徑增殖及發(fā)生轉(zhuǎn)移。多信號通路阻斷劑聯(lián)合應(yīng)用可以彌補(bǔ)該不足[10-11]。EMT是腫瘤細(xì)胞突破基底膜向間質(zhì)浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的早期事件，有眾多基因及信號通路參與其中[12]。EMT過程中，上皮志物E-cadherin、ZO-1等表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、Snail等表達(dá)上調(diào)，使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)病灶，突破基底膜最終形成遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移[13]。

本研究通過對比分析發(fā)現(xiàn)，BEZ235、AZD6244聯(lián)合應(yīng)用可以在體外協(xié)同抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖及遷移。MTT比色法觀察BEZ235、AZD6244聯(lián)合用藥對人宮頸癌細(xì)胞株Hela和SiHa的生長抑制情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組較BEZ235組、AZD6244組、對照組抑制作用更強(qiáng)。筆者在劃痕實驗中發(fā)現(xiàn)，用藥48h后BEZ235聯(lián)合AZD6244顯著抑制Hela細(xì)胞的遷移。為進(jìn)一步探明BEZ235、AZD6244協(xié)同抑制宮頸癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，用Western blot檢測EMT相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用BEZ235、AZD6244，Hela細(xì)胞上皮表型明顯增強(qiáng)，而間質(zhì)表型受到抑制，提示BEZ235、AZD6244聯(lián)合應(yīng)用抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移可能是通過抑制其EMT途徑而實現(xiàn)的。

本研究結(jié)果證實，BEZ235聯(lián)合AZD6244可以在體外協(xié)同抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，并通過抑制EMT途徑抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移，因此本研究對臨床治療宮頸癌提供了新的理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。