王 芳 岳朝敏 Andreea David 林潔茹 何宇城 鄧 剛

(浙江師范大學化學與生命科學學院1，金華 321004)(浙江師范大學行知學院2，金華 321004)

分子蒸餾(Molecular Distillation, MD)，又叫短程蒸餾，是一種特殊的液-液分離技術，它是依據(jù)不同物質分子運動平均自由程的差異來實現(xiàn)分離。分子蒸餾是一種工作在高真空(0.1～100 Pa)，低沸騰溫度(20～65℃)條件下的分離技術[1]，非常適合熱敏性、高沸點物質的分離[2-3]，因此近年來該技術被廣泛應用于油脂脫酸、不飽和脂肪酸的精制、油溶性脂肪酸的提純等領域[4-7]。植物精油的主要成分是醛、酮、醇類，大部分為萜類化合物，具有高沸點、熱不穩(wěn)定及易氧化等特點[8]，傳統(tǒng)分離方法如精餾法、浸提法等易引起分子重排、氧化等，導致精油成分破壞[9-10]，而真空低溫條件下的分子蒸餾技術不僅可能保證精油的品質，而且能夠高效提純或富集精油中的一些香氣成分或活性成分，是一種理想而有前景的精油精制方法。

近年來有關分子蒸餾用于精制植物精油的研究日新月異，主要研究集中工藝優(yōu)化[11]、精油脫萜脫毒[12]、精油賦香性[13]等方向，尚需加強分子蒸餾在組分多雜植物精油的應用基礎研究，考察分子蒸餾如何實現(xiàn)對植物精油分級精煉，進而達到甄別香氣、濃縮活性以及脫除雜質的目標。本研究實驗材料為琯溪蜜柚[Citrusgrandis(L.) Osbeck]的果皮精油，由于柚子屬大宗水果，種植面積大，年產鮮果上千萬噸。目前國內精油市場規(guī)模在200億元～220億元[14]，精油的使用廣泛[15]，但精深加工方法不多，精油附加值低。本實驗對水蒸氣蒸餾得到的柚皮精油，嘗試采用了二階段分子蒸餾，通過調控關鍵蒸餾條件，最終得到差異明顯的多種餾分，結合氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)的組分分析和各餾分的抗氧化活性的測定，找尋并富集柚皮精油抗氧化成分。

1 材料與方法

1.1 材料

柚皮精油：采用水蒸氣蒸餾法從琯溪蜜柚皮中制得，淡黃色，用無水硫酸鈉干燥，過濾后將粗精油存于棕色瓶中，-20 ℃保藏。

1.2 儀器與試劑

KDL 5分子蒸餾儀：德國UIC公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜儀：美國Agilent公司；UV-2550紫外可見光分光光度計：日本Shimadzu公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸(ABTS)、過硫酸鉀(K2S2O8)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷、環(huán)己酮為色譜純：德國Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 柚皮精油分子蒸餾實驗設計

柚皮精油分子蒸餾實驗條件的調控及選取是綜合考慮了對各餾分組成分析和收率的實時測定結果，其中可變調控參數(shù)包括蒸發(fā)器溫度為20～60 ℃，一級冷凝器為-10～15 ℃，系統(tǒng)真空度1～10 Pa，其他參數(shù)包括二級冷凝器溫度(-20 ℃)、冷肼溫度(液氮冷卻)、刮膜轉速(100 r/min)，進料流速(1 mL/min)在整個蒸餾操作過程中均保持不變。對200 mL柚皮精油進行了第一階段分子蒸餾后，根據(jù)GC-MS對殘留液(1RH，重餾分)、一級冷凝器冷凝液(1DM，中間餾分)，二級冷凝器冷凝液(1DL，輕餾分)分析結果，再對組分沸點分布寬的1RH進行了第二階段分子蒸餾，調節(jié)蒸餾溫度為25 ℃，一級冷凝器為-10 ℃，真空度190～200 Pa，其他條件不變，得到兩個餾分，分別記為2RH，2DM。

1.3.2 柚皮精油成分的GC-MS分析

采用GC-MS法分析了分子蒸餾各餾分及原油的化學組成。氣相色譜條件：毛細管柱為Agilent HP-5,30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣為高純氦氣(純度>99.99%)，流速1 mL/min；進樣溫度250 ℃，進樣量1 μL，分流比1∶50。采用程序升溫：初溫40 ℃(保持3 min)，然后以5 ℃/min升溫至200 ℃(保持5 min)；再以2 ℃/min升溫至250 ℃。質譜條件：EI離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；四級桿溫度150 ℃；溶劑延遲2 min；接口溫度280 ℃；掃描范圍40～400 amu，掃描速率3.99 scans/s[16]。

精油組分檢測：通過測定相應系列的正烷烴的保留指數(shù)(RI)來確定各組分的RI值，并結合比對NIST質譜數(shù)據(jù)庫(G1036A, revision D.01.00)和已報道的相關文獻[17]，得到柚皮精油各餾分的化學組成；以環(huán)己酮作為內標物，通過氣相色譜對各餾分中的各成分進行了定量分析。

1.3.3 柚皮精油抗氧化實驗

1.3.3.1 清除DPPH·活力測定

移取0.2 mL 20 mg/mL甲醇精油溶液分別與3 mL 0.004%的DPPH·甲醇溶液混合均勻，置于暗處，室溫下反應30 min，在517 nm下測定吸光值Ax,DDPH[18-19]。DPPH·的清除率計算：

式中：A0,DDPH為甲醇對照組。

1.3.3.2 清除ABTS+·活力測定

取7 mmol/L ABTS儲備液和2.45 mmol/L過硫酸鉀儲備液等體積混合均勻，在黑暗室溫下靜置12～16 h，得到ABTS+·母液。用甲醇稀釋母液，2.5 min后，734 nm處測得吸光度值約為0.7±0.05，稀釋后的溶液為ABTS+·工作液。取3.6 mL工作液加0.4 mL 20 mg/mL甲醇精油溶液，振搖10 s，以充分混合，黑暗處靜置2.5 min，在734 nm處測得吸光值Ax,ABTS[20]。ABTS+·清除率計算：

式中:A0,ABTS為甲醇對照組。

1.3.3.3 相對抗氧化活性等級的計算

為了更直觀地了解分子蒸餾后各餾分抗氧化活性的增益或減損，定義了相對抗氧化活性等級(Ralative Level of Antioxidant, RLA)，以餾分油比原油每增加或減少20%為一個等級，記為一個“+”，以此類推，計算公式：

2 結果與分析

2.1 不同餾分化學組成及組分流向

柚皮精油沸點范圍分布在150～300 ℃之間，與普通的油脂、脂肪酸物料相比，組分多，分子量小，沸點分布窄，因此采用分子蒸餾技術來精煉精油，難度大，需要精準調控操作參數(shù)，其中蒸發(fā)溫度、冷凝溫度及系統(tǒng)真空度變化均會引起較大的組分流向的響應。分子蒸餾條件對餾分得率的影響見表1，若真空度和蒸發(fā)溫度設置過高(實驗序號1)，精油中多數(shù)組分的平均自由程遠大于蒸餾距離，所有組分均被兩級冷凝器俘集，因而完全無重餾分；隨著蒸發(fā)強度減弱(實驗序號2～4)，即降低系統(tǒng)真空度(絕對壓力升高)或降低蒸發(fā)溫度，則精油中越來越多組分將無法汽化而直接降液成為重餾分。當真空度為1～10 Pa、蒸發(fā)溫度為20 ℃時(實驗序號5～7)，該蒸發(fā)強度下重餾分占比約為44%～46%，進而設置一級冷凝溫度為-10 ℃、二級冷凝溫度為-20 ℃，則大部分平均自由程大于蒸餾距離的組分部分被一級冷凝器俘集，而少部分平均自由程遠大于蒸餾距離(低沸點組分)的組分在一級冷凝面無法及時冷凝，發(fā)生“彈射”而流向二級冷凝器并被俘集。柚皮精油一次蒸餾后各餾分的化學組成分析如圖1所示，結合GC-MS分析，這些“彈射俘集”的輕餾分得率低于20%，但組分沸點分布窄(圖1d)，基本不含中間餾分中的組分，分離效果好，第二階段分子蒸餾實驗也是依據(jù)此現(xiàn)象進行設計。

柚皮精油的化學組成及含量見表2，在柚皮精油中共鑒定出33種化學成分，主要成分是香葉醇(156.52 g/L)、D-檸檬烯(66.33 g/L)和β-石竹烯(41.05 g/L)，與文獻報道相符，但含量略有差異[13, 21-22]，可能與果實的生長環(huán)境、生長階段等因素有關[23-24]。在蒸餾溫度為20 ℃，真空度為1～10 Pa的操作條件下進行了一級分子蒸餾，餾分1RH共富集了17個沸點較高的組分，并且這些組分的含量較原油顯著提高，其中香葉醇濃度由原油的152.65 g/L升高到253.90 g/L，濃縮了1.7倍，β-石竹烯由原油的41.05 g/L升高至77.06 g/L，濃縮了1.9倍；餾分1DL也顯著濃縮了原油中低沸點部分的組分，其中D-檸檬烯被最大程度地富集，濃縮比高達4.9。需要指出的是，實驗表明分子蒸餾可將檸檬烯從原油中脫除，并與其他主要成分分離，使得精油有效成分的富集成為可能。

表1 分子蒸餾條件對餾分得率的影響

注：Y表示各餾分的得率。

表2 柚皮精油的化學組成及含量

注：-表示未檢出，化合物沸點從上到下由高到低。

圖1a顯示了柚子原油中絕對含量大于0.5 g/L的26種化學組分，這些組分沸點分布在430～550 ℃范圍內，經過第一次分子蒸餾，餾分1RH富集了未汽化高沸點組分，基本脫除了低沸點的組分，如圖1b所示；餾分1DL富集效應最佳，圖1b顯示了GC-MS的總離子流圖中各組分峰分布窄，并且通過計算組分的摩爾分率可知，1DL中主要含有9種低沸點組分，沸點范圍約在430～550 ℃之間，結合餾分1DM組分分析(圖1c)，1DM中組分分布較廣，即含有重餾分組分，也含輕餾分組分，表明了餾分1DL是那些平均自由程遠大于蒸發(fā)距離、在一級冷凝器上未被冷凝而被二級冷凝器俘集的組分。

注：bp表示各組分在常壓下沸點；RT，RA分別表示GC-MS總離子圖中的保留時間和相對豐度。
圖1 柚皮精油一次蒸餾后各餾分的化學組成分析

根據(jù)抗氧化實驗結果，餾分1RH的抗氧化活性顯著增強，因此對1RH進行了第二次分子蒸餾以期進一步富集抗氧化成分。在蒸餾溫度為25 ℃，真空度為190～200 Pa的條件下進行低強度的分子蒸餾，由于1RH中低沸點組分極少，因此餾出物中僅有兩個餾分2RH和2DM，其中2RH中再次富集了香葉醇和β-石竹烯，濃縮比分別為3.7和4.3，同時又進一脫除了部分的D-檸檬烯。

2.2 不同餾分抗氧化活性分析

測定分子蒸餾所得不同餾分對DPPH.和ABTS+.的清除能力，結果表明抗氧化活性強弱順序為2RH>1RH>2DM>Co(原油)>1DM>1DL，不同餾分對DPPH和ABTS自由基的清除能力如圖2所示。Choi等[25]認為柑橘屬精油對DPPH·的清除能力與香葉醇的含量呈正相關，而Wang等[26]研究了番石榴(PsidiumguajavaL.)精油的抗氧化活性，其主要抗氧化成分是β-石竹烯。由圖2可知，餾分1RH較原油(Co)富集了高沸點組分，尤其是兩個抗氧化成分香葉醇和β-石竹烯，同時脫除了低沸點組分，如D-檸檬烯，因而相應的DPPH·和ABTS+·的清除能力顯著增強，分別較原油提高60%和46%，而餾分1DM和1DL也因抗氧化成分被脫除而活性下降。值得指出的是，精油的生物活性可能是幾種化合物的協(xié)同作用[27]，所以柚皮精油對DPPH·和ABTS+·的清除作用，也可能是以香葉醇和β-石竹烯為主的多種高沸點組分共同作用的結果。

注：標注字母為顯著性分析 (P<0.05)。
圖2 不同餾分對DPPH和ABTS+自由基的清除能力

對抗氧化活性較強的餾分1RH進行了第二次分子蒸餾，對抗氧化成分進行了進一步富集，通過計算各餾分相對抗氧化活性等級，各餾分抗氧化活性富集程度評價見表3，不難發(fā)現(xiàn)餾分2RH的抗氧化活性較餾分1RH又上升一個等級，對ABTS+·的清除能力較原油提高了75%。

表3 各餾分抗氧化活性富集程度評價

2.3 分子蒸餾富集柚皮精油抗氧化成分過程分析

為了更直觀地顯示分子蒸餾用于柚皮精油抗氧化成分富集的效果，分子蒸餾富集柚皮精油抗氧化成分過程分析如圖3所示。圖3匯總了二次分子蒸餾過程中所有餾分的主要抗氧化成分、D-檸檬烯的含量以及對ABTS+·的清除能力，兩種抗氧化成分香葉醇和β-石竹烯的平均自由程分別0.019 cm和0.073 cm，均小于有效蒸發(fā)距離8.6 cm，因而未汽化部分直接沉降于餾分1RH中，而汽化部分冷凝至餾分1DM，極少出現(xiàn)在餾分1DL中，而宏量成分D-檸檬烯的平均自由程為9.1 cm，大于有效蒸發(fā)距離，只要將一級冷凝器溫度控制在較高水平，大部分D-檸檬烯則被冷凝至餾分1DL，顯然脫除宏量成分D-檸檬烯有利于活性成分的富集。對1RH的二次分子蒸餾的富集效果更加明顯，兩種抗氧化成分香葉醇和β-石竹烯的含量提高了1倍以上，活性也得到了顯著提升，再次表明經多次分子蒸餾可以從植物精油中富集濃縮目標活性成分，實際上為植物精油的精制提供了一種非常有效的方法。

圖3 分子蒸餾富集柚皮精油抗氧化成分過程分析

3 結論

植物精油種類繁多，用途廣泛，具有極高商業(yè)開發(fā)價值，但精油原料的穩(wěn)定性、生產的標準化等因素嚴重制約了其應用，我國在精油深加工及高附加值產品研發(fā)上還需加大力度。本研究以柚皮精油為實驗材料，探索了結合GC-MS及活性分析的分子蒸餾技術用于精油抗氧化成分的分離富集，結果表明在分子蒸餾過程中如果能實時地監(jiān)測主要活性成分的流向及活性的變化，并且在了解目標及雜質組分物性參數(shù)的前提下，設計多次特定分子蒸餾可以將精油中的有效成分進行有目的地富集。這種精準的分子蒸餾技術，雖無法取代昂貴的制備型氣相色譜技術作為純化方法，但因其低溫、真空的操作條件及良好富集效率，有望成為植物精油精制的一種方法，拓展了分子蒸餾的用途，具有一定的商業(yè)化應用前景。