◎ 楊曉惠

（湯臣倍健股份有限公司，廣東 珠海 519040）

初生哺乳動(dòng)物的自身免疫防御系統(tǒng)不成熟，難以有效防御細(xì)菌。為使幼體補(bǔ)充必要的免疫物質(zhì)，對(duì)哺乳動(dòng)物初乳中的乳鐵蛋白的攝入異常關(guān)鍵。乳鐵蛋白，簡稱LF（Lactoferrin），是分布于初乳中典型活性單體糖蛋白，可發(fā)揮抗病原微生物的作用，廣譜抗菌能力突出。包括人類在內(nèi)，哺乳動(dòng)物初乳中的LF比后期常乳中含量多出十多倍。高濃度的蛋白表達(dá)下，LF的抗菌活性因其酶解后產(chǎn)生肽段而增強(qiáng)，它們的抗菌優(yōu)勢(shì)并非一般抗生素可比擬，對(duì)細(xì)菌類、病毒、真菌等有廣譜抗性，且無生物毒性，不存在外源性化學(xué)成分。由于LF酶解肽的抗菌模式不定，降低了受作用病原微生物的耐藥性[1]。

1 LF概述

1.1 LF物質(zhì)結(jié)構(gòu)特性

LF，分子量近80 kDa，是一種鐵結(jié)合類單體糖蛋白，形成年限超1.25億年，與轉(zhuǎn)鐵蛋白系同源物質(zhì)，同屬轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。其結(jié)構(gòu)組成上，由對(duì)稱形式的N-葉和C-葉組成[2]。

對(duì)稱兩葉具有同源性，單葉可細(xì)分結(jié)構(gòu)域。單體N-葉和C-葉均可獨(dú)立結(jié)合三價(jià)鐵離子，與鐵元素結(jié)合位置將出現(xiàn)4個(gè)氨基酸殘基。LF的表位電荷分布多為正電荷，因而遇到大量攜帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜后可快速結(jié)合[3]。

LF常常會(huì)在無鐵（apo-LF）與鐵飽和（holo-LF）狀態(tài)中轉(zhuǎn)換，多數(shù)細(xì)胞的apo-LF將被排出細(xì)胞外，而若結(jié)合過量Fe3+則會(huì)變成holo-LF留在細(xì)胞內(nèi)。在人類的LF研究中，為消除水解酶作用并減少受體識(shí)別概率，LF可增加諸如磷酸化、N-聚糖等多元修飾位點(diǎn)。

1.2 LF物質(zhì)功能特性

LF蛋白在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的分布較為廣泛，多見于外分泌液（乳汁、唾液、淚液、鼻分泌物），且在血漿、羊水、膽汁、子宮分泌物、尿液以及中性粒細(xì)胞中也含量較多，相比較而言，屬初乳中含量最高。研究指出，LF可有效調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡、參與骨髓細(xì)胞形成、激勵(lì)細(xì)胞生長、促進(jìn)機(jī)體免疫、增強(qiáng)抗病性及抗高血壓性[2]。LF作為新型抗菌類生物藥物，可有效協(xié)同抗生素及抗真菌制劑作用于哺乳動(dòng)物產(chǎn)生更多病理性作用。

1.3 LF物質(zhì)抗菌方式

①鐵剝奪是基本抑菌機(jī)制。主要是對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的apo-LF或不飽和LF而言，它們對(duì)鐵元素的結(jié)合性與掠奪性極強(qiáng)，主要在體內(nèi)參與細(xì)菌、真菌、病毒等病原性微生物的鐵元素競(jìng)爭(zhēng)，大量結(jié)合鐵離子導(dǎo)致病原性微生物必要的鐵元素得不到補(bǔ)給從而死亡。當(dāng)然，在LF大量結(jié)合鐵離子的過程中，部分微生物難以脫離鐵元素而生成致病性生物膜，整體上的降菌效果顯著。②膜滲透的基本作用機(jī)制原理在于通過電荷吸引來破壞細(xì)胞膜從而殺死病原菌，如對(duì)革蘭氏菌群而言，LF自帶正電荷，與革蘭氏陽性菌磷壁酸或革蘭氏陰性菌脂多糖之間形成電荷吸引，直接擊破細(xì)胞膜，破壞生理功能，提升通透性，同時(shí)使得脂多糖滲出，大量物質(zhì)流失導(dǎo)致病原菌被殺死。③酶抑制主要突出LF的酶體活性降解，從而有效減少各種細(xì)菌毒力因子或黏附蛋白，這樣可有效降低病原體與LF的有機(jī)結(jié)合，降低對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的不良侵入與影響。通常在LF表位攜帶有大量的正電荷，此電荷具有堿性、高密度特征，這樣就將直接與部分細(xì)菌或宿主細(xì)胞的生物分子結(jié)構(gòu)相結(jié)合，因而產(chǎn)生更加明確的非特異性[3]。

2 LF與病原微生物細(xì)胞膜的結(jié)合能力

2.1 LF與細(xì)胞膜脂質(zhì)

在牙周炎的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，引發(fā)牙周炎的主要病菌為牙齦卟啉單胞菌和普雷沃菌，LF與酶解抗菌多肽都能抑制兩種病菌的生長，而LF將結(jié)合病菌細(xì)胞膜上的脂質(zhì)作用來完成抑制效果。

2.2 LF與細(xì)胞膜脂多糖

沙門氏菌與大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜含大量脂多糖物質(zhì)，在與LF結(jié)合作用后，可解除細(xì)胞膜上的脂多糖。據(jù)研究，LF與脂多糖的結(jié)合得益于表位酶解肽段的作用，利用靜電作用等技術(shù)加強(qiáng)酶解多肽體與脂多糖的結(jié)合，可有效緩解脂多糖對(duì)哺乳動(dòng)物機(jī)體刺激性。

2.3 LF與細(xì)胞膜蛋白

LF可利用細(xì)菌細(xì)胞膜表的結(jié)合蛋白促成與膜的結(jié)合。研究表明，若假單胞菌細(xì)胞表面的LF結(jié)合蛋白再次與LF集合，則可有效發(fā)揮阻礙生長的效果。對(duì)溶血性曼氏桿菌而言，LF發(fā)揮的抗菌殺菌作用機(jī)理在于其可結(jié)合菌體的外膜蛋白與孔蛋白。

3 LF的酶解多肽抗菌能力

3.1 Lfcin的抗菌機(jī)理研究

Lfcin是LF于胃部酸性環(huán)境的酶解作用下，由N端釋放的氨基酸殘基肽體，編號(hào)17-41段，自身無法結(jié)合鐵離子，囊括LF的所有生物學(xué)活性。Lfcin在LF結(jié)構(gòu)中可于表面構(gòu)建α-螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖1[4]所示。

圖1 Lfcin（17-41）與Lfampin（268-284）在LF中的位置分布圖

一旦在液相環(huán)境下，因水溶劑影響發(fā)生變構(gòu)作用，將呈現(xiàn)兩個(gè)反相平行的β-折疊結(jié)構(gòu)，如圖2[5]所示。特殊的α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)增加了胞膜脂質(zhì)的親和力，可為LF的細(xì)胞膜結(jié)合提供必要的正向效果保障。

圖2 Lfcin抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和表面電荷分布圖

Lfcin的抗菌殺菌作用機(jī)理，主要是依靠自身正電荷，與LF的膜滲透方式產(chǎn)生機(jī)制相類似，會(huì)與有關(guān)細(xì)胞壁酸質(zhì)或脂多糖發(fā)生靜電吸引作用，從而增加附著力，借助必要的疏水架構(gòu)在細(xì)胞膜中完成脂質(zhì)分子層的變構(gòu)，開辟傳輸路徑后確保抗菌肽體可進(jìn)入細(xì)胞中，或引發(fā)更多細(xì)胞膜的孔洞形成，使得細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)大量流失，從而實(shí)現(xiàn)滅菌效果。相關(guān)作用機(jī)理可利用熒光信號(hào)分子實(shí)驗(yàn)來觀察分析流向，準(zhǔn)確反饋不同細(xì)菌的細(xì)胞膜破裂滅亡情況。

3.2 Lfampin的抗菌機(jī)理研究

Lfampin來自于LF酶解肽段中的268-284部位氨基酸，可形成N端兩親性α- 螺旋結(jié)構(gòu)，且C端的正電荷對(duì)抗菌作用的能力貢獻(xiàn)突出。

Lfampin與細(xì)菌胞膜的結(jié)合，主要是C端正電荷先行吸引細(xì)菌的蛋白外膜，然后由N端螺旋結(jié)構(gòu)深度結(jié)合，顯然通過增加C端的正電荷物質(zhì)數(shù)可提升抗菌活性。在有效實(shí)驗(yàn)中，采用人為干預(yù)的方式增加Lfampin的改造可增加抗菌肽的抗菌能力，如可串聯(lián)改造Lfampin與Lfcin肽段，合成物能夠發(fā)揮更強(qiáng)的細(xì)胞膜結(jié)合能力與抗菌活性。

3.3 LF的其他抗菌肽段抗菌機(jī)理研究

在人類LF的提取合成抗菌肽中，HLR1r能夠產(chǎn)生明顯的革蘭氏菌群抗性。對(duì)多肽LF11而言，自身對(duì)細(xì)胞膜的破壞功效是顯而易見。此外，利用清除非帶電荷殘基、補(bǔ)增肽體N端疏水氨基酸或增加N端酰化作用，都能夠增加多肽LF11的抗菌能力。而多肽L10對(duì)于耐藥性強(qiáng)的真菌殺傷效果顯著，主動(dòng)結(jié)合細(xì)菌脂質(zhì)與脂多糖，增強(qiáng)胞膜的通透性，從而有效滅殺細(xì)菌。經(jīng)過研究，不少源自LF單倍的抗菌多肽都可發(fā)揮明顯的抑制真菌的作用。LF蛋白衍生多肽HLopt2和HLBD1可殺傷假絲酵母，特別是HLopt2能夠促使酵母菌細(xì)胞膜表出現(xiàn)大量凹陷或坑洞，增加對(duì)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)破壞力，發(fā)揮殺菌作用。

4 結(jié)語

通過對(duì)哺乳動(dòng)物初乳中的乳鐵蛋白抗菌機(jī)理的諸多學(xué)術(shù)研究成果的梳理與總結(jié)可知，哺乳動(dòng)物初乳所含LF能夠發(fā)揮出較為穩(wěn)定的抗菌生活活性，其活性往往受限于自身對(duì)細(xì)菌胞膜的結(jié)合能力，同時(shí)受LF酶解多肽段的抗菌能力的影響。因此，人們可視LF蛋白為重要的抗菌類物質(zhì)主體，是重要的展現(xiàn)膜結(jié)合能力的參與物質(zhì)，同時(shí)充當(dāng)著降解酶的重要基礎(chǔ)物質(zhì)。綜上所述，LF的有效抗菌機(jī)理是先與細(xì)菌胞膜結(jié)合，使得LF發(fā)生一定的變構(gòu)，提升對(duì)蛋白酶的敏感度， 且LF降解后可產(chǎn)生具有更高抗菌活性的多肽體，通過破壞細(xì)胞膜增加膜通透性來加快細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流失，從而達(dá)到殺菌的目的。