王春芳，劉 兵，孫 光，徐瑜杰，趙國棟

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院胃腸外科，海南 海口 570208

腫瘤細(xì)胞的惡性增殖與細(xì)胞的異常代謝有著密切的關(guān)系。已有研究[1-3]證實(shí)，氧氣充足條件下，腫瘤細(xì)胞仍然可以通過糖酵解途徑供能完成自身的生物學(xué)行為。因此，阻斷和抑制糖酵解途徑可能是治療腫瘤的潛在途徑。果糖-1, 6-二磷酸酶1(FBP1)是一種糖異生限速酶，可轉(zhuǎn)化糖酵解的中間產(chǎn)物阻斷糖酵解過程，也可作為轉(zhuǎn)錄輔助因子，參與細(xì)胞的代謝過程。FBP1在肺癌、乳腺癌和肝癌等多種腫瘤組織中低表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，沉默肝癌中FBP1表達(dá)可通過促進(jìn)細(xì)胞的糖酵解，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4-6]。近年來有研究[7]指出，F(xiàn)BP1在胃癌中低表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示FBP1與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。因此，本研究以胃癌SGC7901細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)FBP1對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖遷移和糖降解的影響及其機(jī)制，以期為胃癌的發(fā)展機(jī)制和治療提供新的理論依據(jù)及治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料人正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞、胃癌SGC7901細(xì)胞和293T細(xì)胞購自美國ATCC，DMEM培養(yǎng)液、opti-MEM、青/鏈霉素、胰蛋白酶購自美國Corning公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗、缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α，1∶800)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT-1，1∶1 000)特異性一抗購自美國Santa Cruz公司，lipo2000購自美國Invitrogen公司，二甲亞砜、FBP1 shRNA和FBP1(1∶1 000)抗體購自美國Sigma-Aldrich公司，pLenti6.3/FBP1和pcDNA3.1購自美國GE Health Dharmacon公司。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒和化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Roche公司。CCK-8試劑盒購自南京凱基生物公司。PFK ELISA試劑盒購自美國Sigma公司，血?dú)夥治鰞x測試卡購自美國Abbott公司，酶標(biāo)儀、蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Forma Series Ⅱ公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及病毒轉(zhuǎn)染293T、SGC7901和GES-1細(xì)胞采用含胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37 ℃和95%濕度的孵育箱中。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%時(shí)，加質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取生長良好的293T細(xì)胞，以5×105ml-1細(xì)胞接種至含血清DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿上，常規(guī)培養(yǎng)24 h。在離心管中加入5 μg目標(biāo)shRNA、10 μg pEXQV、10 μg pVSV-G 和2 ml opti-MEM充分混合。在另一離心管中加入1 μg opti-MEM和75 μg lipo2000充分混合。兩離心管溶液混合，37 ℃下反應(yīng)30 min。取5 ml培養(yǎng)皿中的293T細(xì)胞，加入上述混合液，常規(guī)培養(yǎng)24 h。次日，換培養(yǎng)液后加入丙酮酸鈉10 μl孵育24 h。以3 000 r/min離心10 min，存儲(chǔ)備用。取生長良好的對(duì)數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞，以細(xì)胞濃度5×105ml-1每孔接種100 μl 至6孔細(xì)胞板上，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)、NC shRNA組(轉(zhuǎn)染空載體 pcDNA3.1質(zhì)粒)和FBP1 shRNA組(轉(zhuǎn)染pLenti6.3/FBP1質(zhì)粒)。待細(xì)胞貼壁時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組更換成含有1 ml DMEM培養(yǎng)液和1 ml病毒上清，再加入10 μg/ml凝膠胺孵育24 h。更換DMEM培養(yǎng)液后，加入2 μg/ml嘌呤霉素，常規(guī)培養(yǎng)48 h。

1.3RT-PCR檢測收集生長良好的對(duì)數(shù)生長期SGC7901細(xì)胞和GES-1細(xì)胞，以Trizol法提取總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟獲得模板鏈cDNA。根據(jù)設(shè)計(jì)的內(nèi)參GAPDH引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′和5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′以及FBP1引物：5′-CGCGCACCTCTATGGCATT-3′和5′-TTCTTCTGACACGAGAACACAC-3′，采用PCR儀參照如下反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，35個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。2-ΔΔCT法計(jì)算FBP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。相同方法檢測對(duì)照組、NC shRNA組和FBP1 shRNA組中FBP1 mRNA的表達(dá)水平。

1.4Westernblotting檢測收集生長良好的對(duì)數(shù)生長期SGC7901細(xì)胞和GES-1細(xì)胞，于冰上加蛋白裂解液提取總蛋白，經(jīng)BCA蛋白檢測試劑盒對(duì)總蛋白定量后，取50 μg上樣至SDS-PAGE電泳，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔。轉(zhuǎn)膜后置于含有50 g/L脫脂奶粉的封閉液封閉。加入1∶800～1∶1 000倍稀釋的特異性一抗4 ℃下反應(yīng)24 h，再加入1∶2 000倍稀釋的二抗37 ℃反應(yīng)2 h。于暗室中曝光后，以凝膠成像系統(tǒng)和Quantity One 4.6.2軟件分析。相同方法檢測對(duì)照組、NC shRNA組和FBP1 shRNA組中FBP1、GLUT-1和HIF-1α蛋白的表達(dá)水平。

1.5CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況。收集慢病毒感染轉(zhuǎn)染48 h后的對(duì)照組、NC shRNA組和FBP1 shRNA組的SGC7901細(xì)胞，制備濃度為3×105ml-1的單細(xì)胞懸液。在96孔細(xì)胞板上每孔接種100 μl，于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8溶液10 μl，混合后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在490 nm的吸光度(OD)值，以細(xì)胞存活率(%)=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%公式計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。選取生長良好的對(duì)照組、NC shRNA組和FBP1 shRNA組細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液。以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室中，并于下層加入500 μl含有100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)基，均設(shè)置3個(gè)平行孔，于培養(yǎng)箱中孵育48 h后取出，加入質(zhì)量濃度為40 g/L甲醛溶液1 ml，37 ℃下固定10 min。清洗后，再加入濃度為5 g/L結(jié)晶紫溶液1 ml，染色 30 min。磷酸緩沖液清洗晾干。濕棉簽小心擦去上室中沒有穿膜的細(xì)胞，采用光學(xué)顯微鏡，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.6胞內(nèi)PFK和胞外乳酸含量檢測選取生長良好的對(duì)照組、NC shRNA組和FBP1 shRNA組細(xì)胞，分成2份，一份用于檢測胞內(nèi)PFK含量：加入蛋白裂解液提取總蛋白，并以BCA法對(duì)其定量。采用PFK ELISA檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞內(nèi)PFK含量。另一份用于檢測胞外乳酸濃度：按照每孔100 μl(細(xì)胞濃度為3×105ml-1)接種對(duì)照組、NC shRNA組和FBP1 shRNA組細(xì)胞至96孔板上，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，參照血?dú)夥治鰞x測試卡使用說明書步驟測定各組細(xì)胞外乳酸含量。

2 結(jié)果

2.1FBP1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及慢病毒感染轉(zhuǎn)染效果RT-PCR檢測人正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞和胃癌SGC7901細(xì)胞中FBP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.08和0.21±0.02；Western blotting檢測兩種細(xì)胞中FBP1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.63±0.04和0.13±0.01(見圖1A)。SGC7901細(xì)胞中FBP1 mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均明顯低于GES-1細(xì)胞(P<0.05)。 慢病毒轉(zhuǎn)染pLenti6.3/FBP1質(zhì)粒和空載體pcDNA3.1質(zhì)粒后分別轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測其轉(zhuǎn)染效果(見表1、圖1B)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1質(zhì)粒的NC shRNA組細(xì)胞的FBP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯改變(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染pLenti6.3/FBP1質(zhì)粒的FBP1 shRNA組細(xì)胞中FBP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。

圖1 Western blotting檢測胃癌細(xì)胞中FBP1蛋白的表達(dá) A：FBP1蛋白在胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和胃癌SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)；B：慢病毒轉(zhuǎn)染后各組SGC7901細(xì)胞中FBP1蛋白的表達(dá)Fig 1 The expression of FBP1 protein in gastric cancer cells detected by Western blotting A: expression of FBP1 protein in gastric epithelial cell GES-1 and gastric cancer SGC7901 cells; B: FBP1 protein expression in SGC7901 cells of each group after lentivirus infection

組別FBP1 mRNAFBP1蛋白對(duì)照組1.00±0.070.11±0.03NC shRNA組1.05±0.060.15±0.03FBP1 shRNA組 5.48±1.25* 0.68±0.06*F值37.904168.722P值0.0000.000

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2上調(diào)FBP1表達(dá)對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖和遷移能力的影響CCK-8法和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組SGC7901細(xì)胞的增殖和遷移情況。FBP1 shRNA組中SGC7901細(xì)胞的存活率和穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而NC shRNA組中細(xì)胞存活率和穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2.3上調(diào)FBP1表達(dá)對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞中GLUT-1和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)BP1 shRNA組SGC7901細(xì)胞中GLUT-1和HIF-1α蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，而NC shRNA組中兩種蛋白的表達(dá)水平無顯著變化(P<0.05)(見圖2、表3)。

表2 各組SGC7901細(xì)胞的存活率和穿膜細(xì)胞數(shù)Tab 2 The survival rate and the number of membrane cells of SGC7901 cells in each n=3)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

圖2 Western blotting檢測各組SGC7901細(xì)胞中GLUT-1和HIF-1α蛋白的表達(dá)Fig 2 The expressions of GLUT-1 and HIF-1α proteins in SGC7901 cells of each group tested by Western blotting

組別GLUT-1HIF-1α對(duì)照組0.78±0.060.43±0.04NC shRNA組0.82±0.050.45±0.03FBP1 shRNA組0.31±0.03*0.24±0.02*F值103.41441.690P值0.0000.000

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.4上調(diào)FBP1表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)PFK和胞外乳酸含量的影響與對(duì)照組相比，NC shRNA組細(xì)胞內(nèi)PFK和胞外乳酸含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而FBP1 shRNA組細(xì)胞內(nèi)PFK和胞外乳酸含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表4)。

表4 各組SGC7901細(xì)胞內(nèi)PFK和胞外乳酸含量Tab 4 PFK and extracellular lactate contents in SGC7901 cells mmol/L

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

腫瘤細(xì)胞在有氧條件下可通過糖酵解過程為自身供能進(jìn)行惡性增殖，這可能是腫瘤發(fā)展的重要機(jī)制，調(diào)控糖酵解過程也往往可以影響腫瘤細(xì)胞的生長。XU等[8]指出，改善糖酵解能顯著提高大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力；GUO等[9]指出，抑制糖酵解能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。因此，阻斷或抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解過程有望成為治療腫瘤的潛在手段。果糖-1, 6-二磷酸酶(FBP)是糖異生的限速酶，而糖異生是糖酵解的逆反應(yīng)，F(xiàn)BP1屬于FBP家族成員，在維持糖酵解和糖異生平衡過程中發(fā)揮著重要作用。FBP1在多種腫瘤中異常表達(dá)，可介導(dǎo)糖酵解過程參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程。YU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1在胰腺癌中低表達(dá)，通過減少葡萄糖攝取、乳酸生成和關(guān)鍵糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控胰腺癌的糖酵解過程，進(jìn)而影響癌細(xì)胞增殖和侵襲。ZHANG等[11]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP1在肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與肺癌患者預(yù)后不良有關(guān)，恢復(fù)FBP1表達(dá)抑制葡萄糖攝取和乳酸生產(chǎn)，也抑制了肺癌細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的增殖和侵襲。有報(bào)道[8]顯示，F(xiàn)BP1在胃癌組織中異常低表達(dá)，可作為胃癌病情和預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)之一。因此，本研究從糖酵解方面入手研究FBP1在胃癌SGC7901細(xì)胞增殖遷移中的作用，對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展和治療具有重要意義。

本研究通過慢病毒介導(dǎo)成功構(gòu)建FBP1過表達(dá)的SGC7901細(xì)胞后，采用CCK-8法和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SGC7901細(xì)胞的增殖和遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)FBP1表達(dá)可明顯抑制SGC7901細(xì)胞的增殖和遷移。提示FBP1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。該結(jié)果也反向印證了LI等[12]通過下調(diào)FBP1表達(dá)促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的結(jié)果。HIF-1α是廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，缺氧條件下可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境，在腫瘤細(xì)胞能量代謝和血管再生方面發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[13]；GLUT-1是一種重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在調(diào)控葡萄糖攝取，維持糖代謝和調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用[14]。本研究采用Western blotting進(jìn)一步檢測SGC7901細(xì)胞中GLUT-1和HIF-1α蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)FBP1表達(dá)能夠明顯抑制GLUT-1和HIF-1α蛋白。這一結(jié)果與SHI等[15]所發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)FBP1可通過靶向HIF-1α和GLUT1抑制糖酵解進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和遷移的結(jié)果相吻合。此外，本研究還通過檢測SGC7901細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑相關(guān)酶PFK含量和胞外糖酵解終產(chǎn)物乳酸含量進(jìn)一步驗(yàn)證糖酵解水平被抑制的結(jié)果。提示，F(xiàn)BP1可能通過抑制GLUT-1和HIF-1α表達(dá)，降低胞內(nèi)PFK含量，抑制SGC7901細(xì)胞的糖酵解過程，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖和遷移的作用。

綜上所述，F(xiàn)BP1過表達(dá)能夠通過降低細(xì)胞的糖酵解水平抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖和遷移，其作用機(jī)制可能與抑制GLUT-1和HIF-1α表達(dá)有關(guān)。這一結(jié)果進(jìn)一步闡明了胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，也為胃癌以FBP1為靶點(diǎn)的治療提供參考依據(jù)。