陳海燕

(勝利油田中心醫(yī)院，山東東營(yíng)257034)

兒童哮喘是一種由肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞及組分參與的異質(zhì)性氣道疾病，臨床表現(xiàn)以過(guò)敏性喘息等癥狀為主，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，發(fā)病誘因多與環(huán)境及遺傳因素有關(guān)[1,2]。目前,吸入糖皮質(zhì)激素是兒童哮喘患者治療的首選藥物，然而不同患者對(duì)吸入糖皮質(zhì)激素的療效具有明顯的個(gè)體差異，這種個(gè)體敏感性的不同與糖皮質(zhì)激素受體基因的多態(tài)性有關(guān)[3,4]。本研究擬以山東東營(yíng)地區(qū)兒童哮喘患者為對(duì)象，分析糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ單核苷酸多態(tài)性(SNP)及其是否對(duì)激素療效有影響，為探討兒童哮喘發(fā)病機(jī)制及治療策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取2014年10月～2017年6月在勝利油田中心醫(yī)院兒科門診就診的哮喘患兒285例(哮喘組)，符合2006年GINA兒童哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男185例、女100例，年齡3～12(4.7±1.5)歲，患兒1個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素。家長(zhǎng)均簽署知情同意書。對(duì)照組選取勝利油田衛(wèi)生學(xué)校223例本人及三代以內(nèi)直系親屬中無(wú)哮喘史、無(wú)肺部其他疾病史、無(wú)變態(tài)反應(yīng)史的健康學(xué)生志愿者，其中男113例、女110例，年齡3～12(4.7±1.5)歲。

1.2 治療方法 根據(jù)患兒跟蹤隨訪，選取具有良好依從性哮喘組患兒120例，初始霧化吸入布地奈德混懸液1 mg+特布他林霧化液2.5 mg(或5 mg)霧化吸2次，持續(xù)治療15 d。維持期治療根據(jù)前1、3、6個(gè)月評(píng)估降階梯治療，調(diào)整布地奈德吸入量，最低劑量維持0.25 mg/d。

1.3 觀察指標(biāo)與療效評(píng)定 分別在吸入布地奈德治療滿1、3、6個(gè)月時(shí)對(duì)入組患兒進(jìn)行門診或電話隨訪，觀察哮喘患兒的日間癥狀、夜間癥狀、急性發(fā)作情況、應(yīng)急藥物的使用、活動(dòng)受限情況。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)3次隨訪情況，按照哮喘急性發(fā)作次數(shù)進(jìn)行分組，分為低效：出現(xiàn)>1次急性發(fā)作；高效：出現(xiàn)≤1次急性發(fā)作。

1.4 糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ SNP分析 分別采集哮喘組受試患兒與對(duì)照組口腔頰黏膜拭子，利用試劑盒提取基因組DNA，測(cè)定DNA濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用Taqman探針?lè)▽?duì)患兒基因組DNA樣本糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。根據(jù)位點(diǎn)的RS序號(hào)設(shè)計(jì)并合成Taqman引物與MGB探針各2條，探針?lè)謩e使用FAM和VIC標(biāo)記。采用PCR反應(yīng)混合體系10 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，然后在ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行終點(diǎn)讀板，由ABI SDS 2.3軟件判斷得出基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)研究樣本的群體代表性；計(jì)數(shù)資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn) 對(duì)bcl-Ⅰ SNP位點(diǎn)在哮喘組與對(duì)照組中進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)，P>0.05，表明糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ SNP位點(diǎn)在受試群體中處于遺傳平衡狀態(tài)，具有群體代表性。

2.2 兩組糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ基因型頻率及等位基因頻率比較 糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ共有3種基因型：CC純合型、GG純合型和CG雜合型。哮喘組中CC純合型基因型頻率高于其余兩種，GG純合型基因型頻率、G等位基因頻率高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ基因型頻率及等位基因頻率比較

2.3 不同bcl-Ⅰ基因型哮喘患兒的治療效果 對(duì)120例不同基因型哮喘患兒進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)，CC型患者高效52例、低效11例，高效率82.5%；GG型患者分別為10、16例，高效率38.5%；CG型患者分別為15、16例，高效率48.4%。CC型患者高效率高于GG型患者與CG型患者(χ2值分別為16.92、11.84，P均<0.05)。

3 討論

兒童哮喘是由多種細(xì)胞及其組分參與的氣道反應(yīng)性炎癥疾病，其發(fā)病機(jī)制多與關(guān)鍵調(diào)控因子的基因突變有關(guān)[5,6]。目前吸入糖皮質(zhì)激素是兒童哮喘患者長(zhǎng)期治療的首選藥物，可有效控制哮喘癥狀、改善肺功能、降低氣道高反應(yīng)性，減少患者急診和住院次數(shù)，并可望防止兒童哮喘遷延為終身疾患。然而糖皮質(zhì)激素受體基因的變異可降低該受體對(duì)糖皮質(zhì)激素的敏感性，形成激素依賴，這是難治性哮喘的一個(gè)重要原因[7]。SNP是人類細(xì)胞增殖發(fā)育過(guò)程中基因組DNA最常見(jiàn)的變異形式之一，因此對(duì)糖皮質(zhì)激素受體關(guān)鍵基因的SNP分析是探討兒童哮喘及治療策略的重要方法[8]。

糖皮質(zhì)激素的生物學(xué)作用需通過(guò)其受體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。糖皮質(zhì)激素受體是一種由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，其編碼基因包含有10個(gè)外顯子，所表達(dá)的糖皮質(zhì)激素受體可與擴(kuò)散進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)的糖皮質(zhì)激素相結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核中，結(jié)合并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。而糖皮質(zhì)激素受體編碼基因的突變則會(huì)導(dǎo)致受體蛋白結(jié)構(gòu)或表達(dá)異常，從而影響其與糖皮質(zhì)激素的結(jié)合活性，降低糖皮質(zhì)激素治療的敏感性，產(chǎn)生激素抵抗效應(yīng)[10,11]。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于糖皮質(zhì)激素受體基因SNP的研究主要集中于bcl-Ⅰ、ER22/23EK與N3635等3處位點(diǎn)，不同區(qū)域不同人種間研究結(jié)果不盡相同[11]。bcl-Ⅰ位點(diǎn)多態(tài)性是指位于糖皮質(zhì)激素受體基因外顯子2下游646核苷酸處的位點(diǎn)突變，C突變?yōu)镚(TGATCA突變?yōu)門GATGA)[12]。對(duì)于糖皮質(zhì)激素受體bcl-Ⅰ位點(diǎn)多態(tài)性的研究最早出現(xiàn)于胰島素抵抗相關(guān)研究中，隨后的研究表明，bcl-Ⅰ SNP也與氣道阻塞及肺纖維化等疾病相關(guān)[13,14]。Anja等[15]發(fā)現(xiàn)，bcl-Ⅰ SNP與吸煙人群氣道變異嚴(yán)重程度有關(guān)。同時(shí)，bcl-Ⅰ SNP也與肺組織纖維化病變過(guò)程中炎性反應(yīng)的發(fā)生及肺功能的惡化有關(guān)[13]。云哲琳等[12]研究表明，糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ多態(tài)性也與哮喘發(fā)生存在相關(guān)性。本文以山東東營(yíng)地區(qū)兒童哮喘患者為對(duì)象，證實(shí)了糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ基因型頻率分布與正常兒童存在差異，其中G等位基因頻率較高，表明糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ G等位基因突變與該地區(qū)兒童哮喘相關(guān)。

此外，本文對(duì)糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ不同基因型的哮喘患兒進(jìn)行了激素治療，發(fā)現(xiàn)CC型患者治療效果好于GG型患者與CG型患者。由此認(rèn)為，哮喘患兒對(duì)糖皮質(zhì)激素治療敏感性降低的主要原因可能是糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ G等位基因的突變導(dǎo)致了糖皮質(zhì)激素受體蛋白結(jié)構(gòu)或表達(dá)量發(fā)生改變。哮喘的發(fā)生受基因突變及環(huán)境因素共同影響，糖皮質(zhì)激素受體基因的多態(tài)性研究對(duì)于哮喘易感及治療方式的選擇等均具有指導(dǎo)作用，具體臨床應(yīng)用還需以后進(jìn)一步多中心大樣本研究進(jìn)行確認(rèn)。

綜上所述，山東東營(yíng)地區(qū)兒童哮喘糖皮質(zhì)激素受體基因bcl-Ⅰ G等位基因突變；CC基因型哮喘患兒對(duì)于激素治療的敏感性高于GG與CG基因型。該發(fā)現(xiàn)為探討兒童哮喘發(fā)病機(jī)制及治療策略提供了依據(jù)。