許 女，李田田，賈瑞娟，張 浩，王如福

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷030801）

0 引 言

肉制品中的亞硝酸鹽殘留、亞硝胺和生物胺的產(chǎn)生成為重要的食品安全問題。目前對二者控制的方法主要有[1-2]：物理方法：超高壓、輻照和氣調(diào)控制（抑制生物胺產(chǎn)生菌的生長和氨基酸脫羧酶的活性）；化學(xué)方法：植物提取物（姜、蒜、蘆薈、茶多酚等）、抑菌劑（山梨酸鉀、抗壞血酸、延胡索酸酯、葡萄糖酸內(nèi)酯等）；生物方法：亞硝酸鹽和生物胺降解菌發(fā)酵劑（植物乳桿菌、干酪乳桿菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、長膜明串珠菌、木糖葡萄球菌、解淀粉芽孢桿菌等）。相比物理和化學(xué)方法，降解菌發(fā)酵劑具有豐富協(xié)調(diào)產(chǎn)品風(fēng)味、提升產(chǎn)品生理功能、延長產(chǎn)品保質(zhì)期、有利于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化等無可比擬的優(yōu)勢。

肉制品中的亞硝酸鹽殘基與胺生成致癌物質(zhì)亞硝胺。乳酸菌發(fā)酵碳水化合物生成乳酸降低pH值，pH值的降低有利于降解亞硝酸鹽和抑制亞硝胺的生成[3]。另外，也有報(bào)道[4]稱乳酸菌具有亞硝酸鹽還原酶等一系列酶降解亞硝酸鹽。Chen等[5]將清酒乳桿菌、植物乳桿菌等混合菌種應(yīng)用于中國發(fā)酵干香腸中，產(chǎn)品在成熟期間亞硝酸鹽的殘留量和揮發(fā)性鹽基氮的含量均有明顯降低。Sun等[6]采用戊糖乳桿菌、彎曲乳桿菌和清酒乳桿菌混合接種于中國哈爾濱紅腸發(fā)酵中，與對照組相比，發(fā)酵成熟9天后亞硝胺的含量顯著降低。關(guān)于生物胺，Bovercid等[7]采用包含清酒乳桿菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌的混合發(fā)酵劑顯著降低了干發(fā)酵香腸中酪胺、尸胺和腐胺的含量。Tosukhowong等[8]報(bào)道植物乳桿菌可以顯著降低泰國發(fā)酵香腸中尸胺、腐胺、酪胺和組胺的含量。曾雪峰[9]發(fā)現(xiàn)接種了混合菌發(fā)酵劑的酸魚在發(fā)酵過程中酪胺、尸胺、腐胺的積累受到顯著抑制。

綜上所述，以往的研究存在以下問題：1）只是對降解能力表型進(jìn)行了簡單篩選，缺乏對相關(guān)降解基因分布的研究，另外，篩選出的優(yōu)良目的菌株必須不含生物胺生成等相關(guān)潛在基因；2）亞硝胺和生物胺是發(fā)酵肉制品的重要食品安全問題，以往的報(bào)道中，只是進(jìn)行單一的研究，并沒有篩選出對二者同時(shí)具有降解作用，并且降解率高、降解種類多的優(yōu)良菌株，并將其成功地應(yīng)用在發(fā)酵肉制品的試驗(yàn)中。

本文主要考察了不同來源植物乳桿菌的亞硝酸鹽和生物胺的降解活性及相關(guān)基因的分布情況，從中篩選出1株同時(shí)具有高效降解亞硝酸鹽和生物胺活性的優(yōu)良菌株，并將其應(yīng)用在魚肉發(fā)酵香腸中。為乳酸菌亞硝酸鹽和生物胺的降解機(jī)理、基因工程育種進(jìn)行初步的研究基礎(chǔ)工作，對發(fā)酵肉制品的質(zhì)量安全控制、營養(yǎng)功能提升都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

清酒乳桿菌L.saki M4（實(shí)驗(yàn)室前期研究篩選的優(yōu)良肉品發(fā)酵劑菌株，具有較強(qiáng)的NaCl耐受性，產(chǎn)蛋白酶和細(xì)菌素的能力），植物乳桿菌，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保存。

細(xì)菌提基因組試劑盒，購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)緩沖液、10×Loading Buffer，購自大連寶生物工程有限公司。二乙基亞硝胺（NDEA），二甲基亞硝胺（NDMA），甲基乙基亞硝胺（NMEA），N-亞硝基嗎啉（NMOR）標(biāo)準(zhǔn)品，美國 Accustandard公司；各種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，美國 Sigma公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Veriti PCR 擴(kuò)增儀（溫度精度為±0.25 ℃），美國ABI 公司；電泳成套設(shè)備，美國 Bio-rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Alpha Innotech公司；臺式高速冷凍離心機(jī)，美國Sigam公司；GENESYSTM5型分光光度計(jì)（波長精度為±0.5 nm），日本Spectronic公司；Trace1300氣相色譜-TraceISQ質(zhì)譜連用儀、戴安U3000液相色譜儀（波長精度為±0.1 nm），賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1菌株降解亞硝酸鹽能力的測定

參考文獻(xiàn)[10-11]中乳酸菌降解亞硝酸鹽的測定方法，并進(jìn)行改良。將不同來源的植物乳桿菌菌株，于乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（deMan rogosa sharpe，MRS）中活化后，按3%接種量接種于100 mL含 0.1 mg/mL NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每隔24 h取樣，采用鹽酸萘乙二胺光度法于波長540 nm下測定培養(yǎng)液中亞硝酸鹽的含量，不接菌的空白培養(yǎng)基吸光度為 A0，樣品吸光度為AS，亞硝酸鹽降解率如式 (1)：

1.3.2 菌株產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的測定[12]

按照 GENMED公司細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶總活性比色法定量檢測試劑盒說明進(jìn)行。即通過底物亞硝酸鹽被催化產(chǎn)生氨或一氧化氮的同時(shí)，人工電子供體還原型甲基紫精氧化后呈現(xiàn)吸光峰值的變化，采用比色法來測定樣品中亞硝酸鹽還原酶總活性。

1.3.3 菌株降解生物胺能力的測定[13]

將不同來源的植物乳桿菌菌株，于MRS培養(yǎng)基中活化后，按3%接種量接種于200 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，4℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，磷酸鹽緩沖液洗滌2次后，將菌體重懸到含8種生物胺各100 mg/L的0.05 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液中，調(diào)整菌濃度為OD600=0.8，37℃靜置培養(yǎng)24 h，以不接菌的生物胺磷酸鹽緩沖液作為空白對照組。8 000 r/min離心10 min收集上清液，采用Dns-Cl柱前衍生HPLC-FLD法測定上清液中各生物胺含量，計(jì)算降解率。

1.3.4 亞硝酸鹽和生物胺降解及生成相關(guān)基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

參考文獻(xiàn)[12,14-15]等發(fā)表的引物序列，采用 PCR方法對亞硝酸鹽還原酶疑似基因（HP、GR、ORD），生物胺生成相關(guān)基因（hdc-組氨酸脫羧酶，tdc-酪氨酸脫羧酶，odc-鳥氨酸脫羧酶）和生物胺降解基因suf I進(jìn)行檢測。

1.3.5 植物乳桿菌在魚肉發(fā)酵香腸的應(yīng)用

1）發(fā)酵劑制備

將L. plantarum CP3和 L.saki M4按3%接種量接種于200 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，8 000 r/min離心10 min收集菌體，生理鹽水洗滌后重懸，使菌體濃度達(dá)到1010cfu/mL。

2）魚肉發(fā)酵香腸制備

參考文獻(xiàn)[16]中的魚肉發(fā)酵香腸制備工藝，并進(jìn)行改良。取新鮮青魚去骨取肉后勻漿，制成魚肉糜，向魚肉糜中加入2%鹽、3%白砂糖、1%蔥姜料酒、8%玉米淀粉及10%的水，攪拌均勻，接入1%的發(fā)酵劑，與魚肉糜混合均勻后灌入腸衣中結(jié)扎成型，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，相對濕度為90%，發(fā)酵24 h，每隔12 h取樣測定亞硝胺、生物胺及微生物的變化。

3）理化及微生物指標(biāo)測定

①微生物的測定[17]

總菌數(shù)、乳酸菌、假單胞菌、腸桿菌和酵母菌分別采用平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、乳酸菌培養(yǎng)基（deMan Rogosa Sharpe，MRS）、谷氨酸鹽淀粉酚紅瓊脂（glutamate starch phenol red agar，GSP）、腸桿菌計(jì)數(shù)瓊脂（violet red bile dextrose agar，VRBD）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）。

②亞硝胺的測定[6]

樣品處理：取1 g絞碎樣品，加入9 mL飽和食鹽水，充分混勻后，在400 r/min、50 ℃條件下用固微相萃取儀（藍(lán)色平頭PDMS/DVB65 μm萃取頭）萃取30 min，上機(jī)檢測。

色譜條件：使用安捷倫氣相7890A和氣質(zhì)5975C聯(lián)用儀進(jìn)行測定。選用不分流模式，色譜柱為 DB-WAX 122-7032（30 m×0.25 mm），柱溫 250℃，流速 1.2 mL/min。

③生物胺的測定[17]

樣品處理：稱取5 g待測樣品加入20 mL 0.4 mol/L的高氯酸進(jìn)行研磨，4℃、8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液用0.4 mol/L的高氯酸定容到50 mL。采用1.3.3中的Dns-Cl柱前衍生HPLC-FLD法測定上清液中各生物胺含量。

pH值，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA），揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N），非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）及游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AA）等其他理化指標(biāo)的測定

按照文獻(xiàn)[18]中報(bào)道的方法對發(fā)酵魚肉香腸中pH值，TBA，TVB-N，NPN及FAA等指標(biāo)進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解亞硝酸鹽菌株的篩選

按照1.3.1中的方法，考察了分離自醋醅（CP-cupei）、泡菜（SK-sauerkraut）、乳制品（MP-milkproduct）和青貯飼料（EL-ensilage）中的19株植物乳桿菌降解亞硝酸鹽的能力。如表 1所示，所有菌株均具有一定的亞硝酸鹽降解能力，并且與降解時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。但各株菌的降解能力有很大差異，L. plantarum CP3和MP1的亞硝鹽酸降解能力最強(qiáng)，72 h的降解率分別達(dá)到95%和97%。

關(guān)于植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的酶活對于研究乳酸菌發(fā)酵香腸中的乳酸菌的作用具有重大意義。研究報(bào)道[4]證實(shí)，植物乳桿菌在亞硝酸鹽的誘導(dǎo)下，能夠產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶。以往關(guān)于亞硝酸鹽還原酶的研究大都集中在泛養(yǎng)硫球菌（Thiosphaera pantotropha），脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)，莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)，施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri), 綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等反硝化菌中，這些菌能夠?qū)⑾跛猁}或者亞硝酸鹽降解生成一氧化二氮（nitrous oxide，N2O），一氧化氮（nitric oxide，NO）和氮?dú)猓╪itrogen，N2），這個(gè)過程中的關(guān)鍵酶就是亞硝酸鹽還原酶[12]。近年來，隨著發(fā)酵泡菜、香腸亞硝酸鹽的安全性問題的關(guān)注，才激起對傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌株的亞硝酸鹽還原酶的研究熱點(diǎn)。G?tterup等[19]從發(fā)酵香腸、煙熏烤腸和腌肉中，篩選出9種可以發(fā)酵產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶的Staphylococcus，在 30℃、pH值為7.0、轉(zhuǎn)速為 150 r/min的條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，其最終亞硝酸還原酶酶活在 6～42 U。Neubauer等[20]也研究了發(fā)酵香腸中分離的Staphylococcus carnosus 中亞硝酸還原系統(tǒng)的分子特性，表明厭氧和亞硝酸鹽是亞硝酸還原酶產(chǎn)生的誘導(dǎo)因素。但是，關(guān)于乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的研究比較少。表 1中列出了19株植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的測定結(jié)果，除菌株CP5，CP6，SK3，EL2和EL3外，其他菌株都呈現(xiàn)出亞硝酸鹽還原酶陽性，這同時(shí)印證了CP5，CP6，EL2和EL3這4株菌亞硝酸鹽降解率偏低的結(jié)果，但令人感興趣的是SK3菌株雖然顯示亞硝酸鹽還原酶陰性，但是其亞硝酸鹽的降解率卻高達(dá) 80%。相似地，Dodds等[21]也證實(shí)，清酒乳桿菌（L.sake）雖然具有降解亞硝酸鹽的能力，但檢測不到酸鹽還原酶的活性，推測菌株產(chǎn)生的其他化學(xué)組分(如次生代謝產(chǎn)物、小分子物質(zhì)等)也可能造成亞硝酸鹽的降解；并且Dodds等[21]還證明乳酸菌對亞硝酸鹽的降解主要分為酶降解和酸降解 2個(gè)階段，在發(fā)酵初期以酶降解為主，在發(fā)酵的后期以酸降解為主。

有研究表明[12]，乳酸菌的HP（hypothetical protein）基因編碼的一個(gè)未知蛋白具有顯著降解亞硝酸鹽的能力，同時(shí)，GR基因（編碼谷胱甘肽還原酶，glutathione reductase）和 ORD基因（編碼一氧化還原酶，oxidoreductase）編碼的蛋白也呈現(xiàn)出一定的亞硝酸鹽還原酶活性，但活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HP。為了明確植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的類型，初步揭示其降解機(jī)理，為將來育種工作的展開奠定研究基礎(chǔ)，本文初步考察了亞硝酸鹽還原酶疑似編碼基因在植物乳桿菌菌株中的分布情況。表1結(jié)果顯示所有菌株中均含有HP基因，GR和ORD基因的檢出率經(jīng)表 1結(jié)果計(jì)算分別達(dá)到 47.36%和42.10%。關(guān)于乳酸菌的亞硝酸鹽還原酶類型及基因編碼序列鮮有研究，今后需對這 3個(gè)基因編碼蛋白的亞硝酸鹽還原酶活性，與其他反硝化酶之間的基因表達(dá)調(diào)控，及尋找新的編碼亞硝酸鹽還原酶的功能基因等方面作進(jìn)一步的深入研究。

表1 不同植物乳桿菌菌株降解亞硝酸鹽能力及相關(guān)基因和酶的檢測Table 1 Detection of nitrite degradation rate, related genes and enzyme in different Lactobacillus plantarum strains

2.2 降解生物胺菌株的篩選

生物胺普遍存在于食品尤其是發(fā)酵食品中，在發(fā)酵肉制品、發(fā)酵海產(chǎn)品、發(fā)酵乳制品和發(fā)酵蔬菜等發(fā)酵食品中均有生物胺產(chǎn)生的報(bào)道。食品中生物胺的形成主要是由微生物所產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶對游離氨基酸進(jìn)行脫羧作用產(chǎn)生的。微生物主要通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將游離氨基酸送入胞內(nèi)，經(jīng)酶作用生成相應(yīng)的生物胺后再送出胞外，不同的生物胺涉及的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和氨基酸脫羧酶具有特異性，且二胺和多胺的形成相對復(fù)雜，需要多種酶的連續(xù)作用[22]。目前已報(bào)道的食品中的生物胺產(chǎn)生菌包括：分離自奶酪的酪胺產(chǎn)生菌屬于腸球菌屬(Enterococcus)和乳球菌屬(Lactococcus)[23]，Victor等[24]通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-q PCR)檢測到產(chǎn)組胺細(xì)菌；分離到組胺產(chǎn)生菌普通變形桿菌(Proteus vulgaris)[25]，弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)[26]和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)[27]等；腐胺產(chǎn)生菌有戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)[28]和月形單胞菌(Selenomonas ruminatium)[29]等。

目前食品中生物胺最好的控制方法是接種特定微生物能夠降解生物胺。已報(bào)道的生物胺降解菌有干酪乳桿菌 Lactobacillus casei IFI-CA52[30]，植物乳桿菌Lactobacillus plantarum 2142，副干酪乳桿菌Lactobacillus casei subsp. casei 2763，彎曲乳桿菌Lactobacillus curvatus 2771[31]，酒葡萄球菌Staphylococcus cerevisiae JM19[17]，解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciens FS05 和肉葡萄球菌 Staphylococcus carnosus FS19[32]。但已發(fā)現(xiàn)的生物胺降解菌存在生物胺降解種類少，降解率低且降解機(jī)制不明確等問題。篩選優(yōu)良乳酸菌作為生物胺降解菌，可作為發(fā)酵劑應(yīng)用于多種發(fā)酵食品中，并且乳酸菌在機(jī)體內(nèi)會產(chǎn)生多種益生功能。

本文按照1.3.3中的方法考察了不同來源的植物乳桿菌對8種生物胺的降解能力。19株植物乳桿菌表現(xiàn)出不同的生物胺降解活性，總生物胺降解率從20%到77%不等，其中，L. plantarum CP3和MP1的總生物胺的降解能力最強(qiáng)，分別達(dá)到77%和71%。共有6株菌對測試的8種生物胺都具有降解活性。分別有10株（降解色胺）、2株（降解腐胺）、7株（降解組胺）和3株（分別降解酪胺、精胺、亞精胺）的降解率超過50%。

目前認(rèn)為，微生物的生物胺降解活性主要是產(chǎn)生了生物胺氧化酶，菌株降解生物胺的種類與其產(chǎn)生的生物胺氧化酶的種類多少有關(guān)[15]。一些學(xué)者已經(jīng)從節(jié)桿菌（Arthrobacter crystallopoietes）, 甲基營養(yǎng)酵母（Candida boidinii），產(chǎn)氣克雷白(氏)桿菌（Klebsiella aerogenes）, 藤黃八疊球菌（Sarcina. lutea）和紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）中分離出了多種生物胺氧化酶[15]。但是關(guān)于乳酸菌生物胺氧化酶的報(bào)道比較少。Callejón等[15]首次從L. plantarum J16和P. acidilactici分離純化出具有降解生物胺活性的酶，經(jīng)測序比對證明其為生物胺氧化酶類-多銅氧化酶（multicopper oxidase，MCOS），并由sufⅠ基因編碼，初步探討了植物乳桿菌的生物胺降解機(jī)理；并且證明短乳桿菌（Lactobacillus. brevis），德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus. delbrueckii subsp. bulgaricus）, 副干酪乳桿菌（Lactobacillus. paracasei）和戊糖片球菌（Pediococcus. pentosaceus）中也含有此類酶。本文采用PCR技術(shù)檢測了19株植物乳桿菌的胺氧化酶基因suf I的分布情況，結(jié)果如表2所示。

表2 不同植物乳桿菌菌株降解生物胺能力及相關(guān)基因的檢測Table 2 Detection of biogenic amine degradation rate and related genes in different Lactobacillus plantarum strains

19株植物乳桿菌中均含有suf I基因，但表1 中的表型結(jié)果卻顯示19株植物乳桿菌對生物胺的降解作用不盡相同，原因可能是不同植物乳桿菌的 suf I基因上有差異，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物有所不同，也可能存在其他的生物胺降解基因，佟婷婷等[33]也發(fā)現(xiàn)了一株具有降解生物胺能力的布氏乳桿菌t1不含suf I基因，說明還存在其他間接降解生物胺的機(jī)制。

一株優(yōu)良的生物胺降解菌株，不僅具有降解種類和降解率高的特性，還必須不含產(chǎn)生物胺的潛在基因，關(guān)于氨基酸脫羧酶基因的研究，目前主要集中在組氨酸脫羧酶（histidine decarboxylase gene，hdc），酪氨酸脫酸酶（tyrosine decarboxylase gene，tdc）和鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase genehdc，odc）中。本文對19株生物胺降解菌中這 3個(gè)基因的攜帶情況進(jìn)行了研究。從表2可知，19株植物乳桿菌中都不含有odc基因，分離自泡菜中的2株菌SK4和SK5中同時(shí)含有hdc和tdc基因，還有2株醋醅源植物乳桿菌CP5，CP6和3株乳制品源植物乳桿菌MP3，MP4，MP5中只含有tdc基因。由此可知，有些菌株中同時(shí)含有生物胺降解和生成基因，這些潛在的生物胺生成基因，可能會在某種環(huán)境誘導(dǎo)下表達(dá)生成氨基酸脫羧酶，從而催化氨基酸底物生成生物胺，因此，對于生物胺降解優(yōu)良菌株的篩選，必須確保其不含生物胺生成相關(guān)基因。

2.3 亞硝酸鹽和生物胺降解菌在魚肉發(fā)酵香腸中的應(yīng)用

2.3.1 降解菌對魚肉發(fā)酵香腸中微生物的影響

圖 1為乳酸菌對魚肉香腸發(fā)酵過程各種微生物數(shù)量變化的影響。如圖1所示，在整個(gè)48 h的魚肉香腸發(fā)酵過程中，總菌數(shù)呈上升趨勢，添加了乳酸菌發(fā)酵劑處理組香腸中的總菌數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05）。乳酸菌在發(fā)酵過程中大量繁殖，成為優(yōu)勢菌，發(fā)酵48 h后接種發(fā)酵劑處理組中的乳酸菌數(shù)高出對照組 1個(gè)數(shù)量級，達(dá)到10.56 lg cfu/g，但接種單菌（L. plantarum CP3）和混菌發(fā)酵（L. plantarum CP3+L.saki M4，活菌數(shù)比為1:1）沒有顯著差異（P＞0.05）。腸桿菌和假單胞菌作為發(fā)酵香腸的腐敗指示菌，從發(fā)酵開始就開始繁殖，與對照組相比，接種乳酸菌發(fā)酵劑后，顯著抑制了腸桿菌和假單胞菌的生長（P＜0.05），并且混菌的抑菌效果顯著強(qiáng)于單菌（P＜0.05），這是因?yàn)?L.saki M4具有高產(chǎn)細(xì)菌素的能力。Zhang等[34]也在發(fā)酵香腸中報(bào)道了類似的結(jié)果，證明接種乳酸菌發(fā)酵劑或添加乳酸菌素等抑菌物質(zhì)可以抑制病原菌和腐敗菌的生長，保證產(chǎn)品的衛(wèi)生，降低食品安全隱患。另外，研究結(jié)果顯示，接種乳酸菌發(fā)酵劑的魚肉香腸中，發(fā)酵24 h后，與對照組相比，其中的酵母菌顯著降低。而酵母菌對于發(fā)酵香腸的風(fēng)味和質(zhì)地等具有重要的品質(zhì)貢獻(xiàn)作用[35-36]，曾雪峰[9]發(fā)現(xiàn)酵母菌聯(lián)合乳酸菌和葡萄球菌共發(fā)酵酸魚，不僅使最終產(chǎn)品中不飽和脂肪酸、香氣物質(zhì)的含量、質(zhì)構(gòu)和感官等得到了顯著提升，并且發(fā)現(xiàn)酵母菌聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵協(xié)助增強(qiáng)了對酸魚發(fā)酵過程中生物胺產(chǎn)生的抑制作用。本文中接種的乳酸菌在抑制腐敗菌的同時(shí)，對其中的有益菌-酵母產(chǎn)生了一定的抑制作用，為了消除這一不利影響，因此在今后的魚肉香腸發(fā)酵工藝研究中，需要進(jìn)行乳酸菌和優(yōu)良酵母菌聯(lián)合發(fā)酵，細(xì)化接種比例，接種條件，充分考慮二者之間的互作協(xié)同機(jī)制。

圖1 乳酸菌對魚肉香腸發(fā)酵過程各種微生物數(shù)量變化的影響Fig.1 Effect of inoculated Lactobacillus on microbial populations evolution in fish sausages during fermentation process

2.3.2 降解菌對魚肉發(fā)酵香腸中亞硝胺的影響

在酸性條件下，發(fā)酵香腸中的亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛?，不穩(wěn)定的亞硝酸分解為亞硝酐（nitrosan anhydride，N2O3），亞硝酐是活化亞硝化合物，可以與胺類物質(zhì)發(fā)生亞硝基化反應(yīng)生成致癌物質(zhì)N-亞硝胺[6]。

1978年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）大會上對亞硝胺類化合物的致癌性進(jìn)行了評定，認(rèn)為二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）和二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）是（2A組）致癌性強(qiáng)的物質(zhì)，而把亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR），甲基乙基亞硝胺（N-nitrosomethylamine，NMEA），N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR），N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）和 N-二丁基亞硝胺（N-dibutylnitrosamine，NDBA）等列為2B 類致癌物質(zhì)（2B，對人體可能致癌，即在動物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的致癌性證據(jù)尚不充分，對人體的致癌性證據(jù)有限）。中國在 GB 9677-1998食品中亞硝胺限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，肉制品中NDMA不得高于3 μg/kg，NDEA不得高于5 μg/kg。

按照1.3.5中的方法，采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對魚肉發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中各種亞硝胺的變化進(jìn)行了測定，結(jié)果見圖2。圖2表明：除NDMA外，其余亞硝胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在整個(gè)魚肉香腸發(fā)酵過程中都呈現(xiàn)上升趨勢，NDMA的含量在發(fā)酵24 h后，呈下降趨勢。接種乳酸菌發(fā)酵劑處理組的香腸，發(fā)酵12 h后各種亞硝胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降（P＜0.05），并且混種接種優(yōu)于單菌，與對照組相比，發(fā)酵48 h后NDEA，NDMA，NMOR的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別極顯著下降了47.2%（P＜0.01），50%（P＜0.01）和81.89%（P＜0.01）。尤其是 NMEA，在處理組發(fā)酵香腸中沒有被檢測出（P＜0.01），而對照組中NMEA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻高達(dá) 2.2 μg/kg（48 h）。最終，接種了 L. plantarum CP3+L.saki M4的混菌發(fā)酵香腸中總亞硝胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照組極顯著降低了62.76%（P＜0.01）。

圖2 乳酸菌對魚肉香腸發(fā)酵過程各種亞硝胺含量變化的影響Fig.2 Effect of inoculated Lactobacillus on N-nitrosoamine changes in fish sausages during fermentation process

對照組發(fā)酵香腸中NDEA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（6.25 μg/kg）超出國標(biāo)中的規(guī)定限量，而接入乳酸菌發(fā)酵劑后，降為3.3 μg/kg（P＜0.01）。而對照組中NDMA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.8 μg/kg，遠(yuǎn)低于國標(biāo)中的限量，說明NDMA不是此類發(fā)酵香腸的主要安全隱患。另外，試驗(yàn)結(jié)果顯示接種乳酸菌的發(fā)酵魚肉香腸中NMOR的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.56μg/kg（L. plantarum CP3）（P＜0.01）和 1.03 μg/kg（L.plantarum CP3+L.saki M4）（P＜0.01），而未接乳酸菌的對照組香腸中NMOR的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)5.69 μg/kg。NPYR，NPIP和NDBA在本試驗(yàn)中未被檢測出。Nie等[17]報(bào)道乳酸菌之所以可以降解發(fā)酵肉制品中的亞硝胺，除了胺氧化酶等一系列酶的作用外，乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸使pH值降低，也會導(dǎo)致亞硝酸鹽、亞硝酸鹽殘基和亞硝胺的減少。

2.3.3 降解菌對魚肉發(fā)酵香腸中生物胺的影響

圖 3為乳酸菌對魚肉香腸發(fā)酵過程各種生物胺含量變化的影響。

圖3 乳酸菌對魚肉香腸發(fā)酵過程各種生物胺含量變化的影響Fig.3 Effect of inoculated Lactobacillus on biogenic amine changes in fish sausages during fermentation process

圖 3結(jié)果顯示，接種乳酸菌發(fā)酵劑的魚肉發(fā)酵香腸中各種生物胺的含量顯著低于對照組（P＜0.05），發(fā)酵48 h后腐胺、尸胺和酪胺的含量分別降低了 76.83%，93.33%和 88%。腐胺和尸胺是魚肉發(fā)酵香腸中最主要的生物胺，發(fā)酵48 h后，L. plantarum CP3組發(fā)酵香腸中腐胺和尸胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照組極顯著下降了 63.87%（P＜0.01）和80.61%（P＜0.01）。Bovercid等[7]也得到了相似的結(jié)論，證明傳統(tǒng)自然發(fā)酵香腸中檢測出的腐胺和尸胺的含量顯著高于其他種類的生物胺，并且采用乳酸菌發(fā)酵劑接種發(fā)酵后，腐胺和尸胺的含量顯著降低。腸桿菌中的脫羧酶活性很強(qiáng)，被認(rèn)為是腐胺和尸胺最主要的產(chǎn)生者，本文中聯(lián)合接種L.saki M4后，協(xié)同提高了生物胺的降解率（P＜0.01），這是由于L.saki M4具有產(chǎn)細(xì)菌素活性，加強(qiáng)抑制了發(fā)酵魚肉香腸中腸桿菌的生長。

酪胺也是發(fā)酵香腸中主要的生物胺[37]。由圖3可知，添加了乳酸菌發(fā)酵劑的魚肉香腸中酪胺的含量下降極顯著（P＜0.01），降低了將近88%左右，但接種單菌和混菌的降解效果沒有顯著差異。相似地，Liu等[38]采用釀酒酵母發(fā)酵草魚香腸的研究試驗(yàn)中，酪胺的含量也顯著降低。但 Nie[17]和 Zhang等[34]報(bào)道在采用植物乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵的鰱魚香腸和采用漢遜德巴利酵母和解脂耶羅維亞酵母發(fā)酵的干香腸中酪胺的含量反而高于對照組。生物胺的降解機(jī)理復(fù)雜，與所使用菌種、添加量、發(fā)酵基質(zhì)中的其他成分如香辛料等及pH值、滲透壓等有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

組胺是毒性最強(qiáng)的生物胺，對機(jī)體會產(chǎn)生很多健康問題[17]。圖3結(jié)果顯示，發(fā)酵48 h后，對照組發(fā)酵魚肉香腸中組胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 23.45 mg/kg，而接種 L.plantarum CP3+L.saki M4的處理組香腸中組胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降極顯著（P＜0.01），為4.56 mg/kg。魚肉發(fā)酵產(chǎn)品中較低的組胺含量也被Liu[38]，Mah等[39]證明，認(rèn)為只要在原料采購和加工過程中嚴(yán)格衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、操作程序，發(fā)酵終產(chǎn)品中組胺的含量是可以被控制的。

精胺在本試驗(yàn)中未被檢測出。對照組中亞精胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于20 mg/kg，接種乳酸菌發(fā)酵后下降極顯著（P＜0.01），為6.22 mg/kg。這與Nie等[17]報(bào)道的結(jié)果相似，即精胺和亞精胺的含量在發(fā)酵魚肉制品中非常少，推測此類多胺不是有微生物的脫羧作用形成的，而是原料肉中的生理微組分。

2.3.4 降解菌對魚肉發(fā)酵香腸其他理化指標(biāo)的影響

表 3為魚肉發(fā)酵香腸其他理化指標(biāo)的測定結(jié)果。由表3可知，添加乳酸菌發(fā)酵劑菌種的發(fā)酵香腸pH值（P＜0.05）、硫代巴比妥酸（TBA）（P＜0.01）和揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）（P＜0.01）的含量顯著低于對照組，單菌和混菌發(fā)酵差異不顯著（P＞0.05）。添加了乳酸菌發(fā)酵劑的魚肉香腸的pH值顯著降低，低pH值有利于腐敗菌的抑制和亞硝酸鹽和亞硝胺降解。

表3 乳酸菌對魚肉發(fā)酵香腸其他理化指標(biāo)的影響（48 h）Table 3 Effect of inoculated Lactobacillus on other physico-chemical indexes of fish sausages

另外，乳酸菌產(chǎn)生的各種有機(jī)酸，及最終生成的酯類物質(zhì)等，對發(fā)酵魚肉香腸的風(fēng)味具有重要的貢獻(xiàn)作用。TVB-N和TBA值反應(yīng)肉以及肉制品蛋白質(zhì)分解成胺和脂肪氧化程度，是判斷肉制品品質(zhì)的重要指標(biāo)。

3 結(jié) 論

1）L. plantarum CP3對亞硝酸鹽和生物胺的降解能力最強(qiáng)，分別達(dá)到95%和77%，PCR結(jié)果顯示此菌株中含有亞硝酸鹽降解酶（HP、GR、ORD）和生物胺降解的相關(guān)基因（suf I），且不含生物胺生成相關(guān)基因（hdc，tdc，odc）。

2）L. plantarum CP3對發(fā)酵香腸中4種亞硝胺-二乙基亞硝胺（NDEA），二甲基亞硝胺（NDMA），亞硝基嗎啉（NMOR）和甲基乙基亞硝胺（NMEA）的生成都具有顯著的抑制作用，聯(lián)合接種L.saki M4可以協(xié)同提高亞硝胺的降解能力。與對照組相比，接種 L. plantarum CP3+L.saki M4的魚肉香腸，發(fā)酵48 h后腐胺、尸胺和酪胺的含量分別降低了76.83%，93.33%和88%。接種乳酸菌處理組香腸中的腸桿菌、假單胞菌等腐敗菌及pH值、硫代巴比妥酸（TBA）和揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的含量顯著低于對照組。

3）綜上所述，L. plantarum CP3可以顯著抑制魚肉香腸發(fā)酵過程中亞硝胺和生物胺的積累，提升了發(fā)酵香腸的營養(yǎng)質(zhì)量和安全性保證，體現(xiàn)了其良好的開發(fā)應(yīng)用前景。