趙俸涌鄧林華楊乾李德生魏榮平黃山魏明李勤錢旻朱自嚴(yán)

(1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海，200241；2.上海市血液中心，上海，200051；3.中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心，都江堰，611830)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是中國(guó)特有的珍稀野生保護(hù)動(dòng)物，隨著大熊貓數(shù)量增加，大熊貓疾病救治的壓力也隨之增大。在大熊貓疾病救治及野外搶救中，輸血治療十分重要。臨床輸血中關(guān)乎輸血安全及有效性的核心問(wèn)題是血型配合，人類血型的研究已相當(dāng)透徹，其他家養(yǎng)動(dòng)物的血型系統(tǒng)，也有較深入研究。大熊貓血型系統(tǒng)研究甚少，報(bào)道僅僅見(jiàn)于大熊貓輸血急救的案例報(bào)道中[1-8]，故而國(guó)內(nèi)外尚無(wú)針對(duì)大熊貓紅細(xì)胞分型的結(jié)論，亦缺乏大熊貓血型系統(tǒng)的定型試劑。

人類血型定型實(shí)驗(yàn)中，常使用同源性抗血清(多克隆抗體)及異源性單、多克隆血型定型抗體對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行定型實(shí)驗(yàn)。在探索大熊貓紅細(xì)胞血型抗原的研究中，已有研究人員使用人類血清學(xué)血型試劑作為大熊貓紅細(xì)胞血型定型試劑對(duì)大熊貓紅細(xì)胞進(jìn)行血型分型得到以下結(jié)論：在刁玉英等的研究中，使用人源性抗血清作為定型試劑對(duì)大熊貓紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大熊貓與人源性抗M血清發(fā)生凝集，得到大熊貓紅細(xì)胞具有M抗原的結(jié)論[8]；在隨后的研究中，蔡紫珍等、王德春等、陳玉村等通過(guò)大熊貓血液與人類ABO血型系統(tǒng)定型試劑的血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果，得到大熊貓紅細(xì)胞血型類似人類O，Rh+型的結(jié)論[5-7]。但由于以上研究中并沒(méi)有考慮到使用異源性定型試劑時(shí)，試劑中的種間抗體對(duì)于實(shí)驗(yàn)的影響，故異源性單、多克隆抗體在大熊貓紅細(xì)胞定型實(shí)驗(yàn)中是否能發(fā)揮作用，還存在疑問(wèn)?；谝陨显?，本研究使用人類血型定型試劑對(duì)大熊貓紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)并使用小鼠與人類血液、亞洲黑熊(Ursusthibetanus)血漿作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)異源性試劑與大熊貓紅細(xì)胞反應(yīng)性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)歷史文獻(xiàn)中的結(jié)果及本研究中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)中所有實(shí)驗(yàn)流程按照AABB標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行[9]。

1.1.1 血液來(lái)源及抗凝方法

本實(shí)驗(yàn)大熊貓血液樣本采集自中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心的健康圈養(yǎng)大熊貓(2015年第一批次采樣；2016年第二批次采樣)，血液樣本采集后使用EDTA·K2抗凝。

1.1.2 主要試劑及儀器

人類抗A抗B抗體及人類A，B，O試劑細(xì)胞、抗-M、抗-N、抗-D、抗-E、抗-e、抗-C及抗-c抗體購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥責(zé)任有限公司；KA-2200血型離心機(jī)購(gòu)自日本久保田公司，2420離心機(jī)購(gòu)自日本久保田公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血液采集及分離

本實(shí)驗(yàn)涉及血液樣品均通過(guò)中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心及上海市血液中心倫理審查。大熊貓全血血樣來(lái)自中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心的圈養(yǎng)大熊貓，經(jīng)行為訓(xùn)練后，所有血樣采用非麻醉采血方式獲得。使用10 mL及20 mL一次性針筒采血，采集到的大熊貓血樣存放至5 mL EDTA·K2抗凝采血管中。小鼠血液來(lái)源為C57 bL/6小鼠，由本室楊啟修實(shí)習(xí)研究員饋贈(zèng)。人血漿為檢驗(yàn)合格后的廢棄血漿樣品(O型及AB多人份混合；新生兒紅細(xì)胞為單人份)，亞洲黑熊血漿由福州大熊貓研究中心饋贈(zèng)。

所有抗凝全血獲得后，按照AABB標(biāo)準(zhǔn)流程，通過(guò)離心2600 g，5 min對(duì)血漿和紅細(xì)胞壓積進(jìn)行分離，紅細(xì)胞壓積使用生理鹽水洗滌3次后(血清學(xué)離心機(jī)3檔)被制作為2%～5%的紅懸液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，血漿直接被用于檢測(cè)。

1.2.2 血液配合實(shí)驗(yàn)(交叉配血實(shí)驗(yàn))

使用紅細(xì)胞懸液與血漿(異源性多克隆抗體)進(jìn)行血液配合實(shí)驗(yàn)：紅細(xì)胞懸液和血漿以1∶1比例混合，在室溫條件下直接離心。使用血清學(xué)離心機(jī)2檔離心，離心后對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)如下(圖1)。

IgM類異源性單克隆抗體(人類血清學(xué)血型試劑檢測(cè))：紅細(xì)胞懸液和血型試劑以1∶1比例混合，在室溫條件下直接離心。使用血清學(xué)離心機(jī)2檔離心，離心后對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)如下(圖1)。

圖1 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)打分標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 The scoring standard of agglutination strength in BCMTA：4+；B：3+；C：2+；D：1+；E：1+w；F：陰性(-)；G：混合視野(MF)；H：溶血A：4+；B：3+；C：2+；D：1+；E：1+w；F：Negative(-)；G：Mix field(MF)；H：Hemolysis

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)中，使用了人類ABO血型系統(tǒng)定型試劑對(duì)2015年獲得的11份大熊貓血樣中的7例大熊貓紅細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)、使用MN血型系統(tǒng)定型試劑及Rh血型系統(tǒng)常見(jiàn)血型試劑對(duì)2016年獲得的10例大熊貓紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)；使用人類ABO系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)試劑細(xì)胞對(duì)2015年獲得的11份大熊貓血樣中的7例獲得的大熊貓血漿進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)大熊貓紅細(xì)胞與抗-A、抗-B抗體劑均不發(fā)生凝集(表1)，而大熊貓的血漿與人類A型、B型血清學(xué)試劑細(xì)胞均發(fā)生凝集，與O型試劑細(xì)胞凝集略弱，與O型新生兒紅細(xì)胞凝集最弱(圖2)。大熊貓紅細(xì)胞未與MN系統(tǒng)，Rh系統(tǒng)血型檢測(cè)抗體反應(yīng)(表2)。

由于使用人類血型定型試劑對(duì)大熊貓紅細(xì)胞及血漿進(jìn)行檢測(cè)，呈現(xiàn)出全部陰性或全部陽(yáng)性的結(jié)果，且文獻(xiàn)中報(bào)道中對(duì)M抗原的檢測(cè)，使用人源性抗血清與大熊貓紅細(xì)胞檢測(cè)呈陽(yáng)性，為了驗(yàn)證以上結(jié)果是否是由種間抗體造成的。本實(shí)驗(yàn)中使用了人類O型混合血漿及AB型混合血漿，小鼠血漿及亞洲黑熊血漿對(duì)大熊貓血液進(jìn)行了交叉配血檢測(cè)。小鼠血漿與大熊貓紅細(xì)胞配合性試驗(yàn)(交叉配血)格局呈現(xiàn)全部陰性(表3)；人類血漿與大熊貓及小鼠紅細(xì)胞的合性試驗(yàn)(交叉配血)呈現(xiàn)全部陽(yáng)性的格局(表3)；亞洲黑熊血漿與大熊貓紅細(xì)胞配合性試驗(yàn)(交叉配血)呈現(xiàn)一部分陰性一部分陽(yáng)性的結(jié)果。

表1 大熊貓紅細(xì)胞及血漿與人類ABO定型試劑試驗(yàn)(n=7)

Tab.1 Experiments of ABO blood typing reagents with giant panda blood

注：上述表格中使用抗-A、抗-B對(duì)大熊貓血液中紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，使用ABO試劑細(xì)胞對(duì)大熊貓血漿進(jìn)行檢測(cè)；ND表示沒(méi)有進(jìn)行檢測(cè)；n=7：本批次共獲得11例大熊貓血樣，但由于4例血樣總量較低，并未進(jìn)行試驗(yàn)，故樣本數(shù)為7例

Note：Anti-A and anti-B reagents were used in the detection of giant panda RBC，while ABO reagent cells were used in detection of giant panda plasma；ND means not detected；n=7：In the 2015，11 blood sample were got，but only 7 whose volume were sufficient were detected in this study

表2 大熊貓紅細(xì)胞與人類Rh&MN系統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)試劑試驗(yàn)(n=10)

Tab.2 Experiments of human Rh&MN blood group typing reagents with giant panda red blood cell

注：n=10：大熊貓血樣樣本數(shù)為10例

Note：n=10：10 cases of giant panda RBC were used

圖2 大熊貓血漿與人類ABO定型試劑細(xì)胞凝集反應(yīng)現(xiàn)象Fig.2 Agglutination experiments between giant panda plasma with human ABO typing standard cell A：不同個(gè)體大熊貓血漿與人類A型試劑細(xì)胞檢測(cè)；B：不同個(gè)體大熊貓血漿與人類B型試劑細(xì)胞檢測(cè)；C：不同個(gè)體大熊貓血漿與人類O型試劑細(xì)胞檢測(cè)；D：不同個(gè)體大熊貓血漿與人類O型新生兒紅細(xì)胞檢測(cè) A：The reaction between different giant panda plasma and human type-A cell；B：The reaction between different giant panda plasma and human type-B cell；C：The reaction between different giant panda plasma and human type-O cell；D：The reaction between different giant panda plasma and human neonatal type-O cell

表3 大熊貓紅細(xì)胞與異源性血漿交叉配血格局圖(n=6)

Tab.3 Cross matching pattern of between giant panda red blood cell and heterologous plasma at room temp

注：n=6：大熊貓血樣樣本數(shù)為6例

Note：n=6：6 cases of giant panda RBC were used

3 討論

圖2和表1的結(jié)果表明，使用人類血型定型抗體及人類血型試劑細(xì)胞對(duì)大熊貓血液進(jìn)行檢測(cè)，大熊貓紅細(xì)胞與人類抗-A及抗-B，反應(yīng)呈全部陰性(表1)。大熊貓血漿與人類ABO血型系統(tǒng)試劑紅細(xì)胞室溫下即發(fā)生凝集(表1，圖2)。說(shuō)明大熊貓血漿中存在與人類紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的抗體，從該抗體可與3種血型的人類血型試劑細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果來(lái)看，該抗體并不是針對(duì)ABO血型系統(tǒng)某一特定抗原表位，從而無(wú)法說(shuō)明文獻(xiàn)中大熊貓紅細(xì)胞類似人類O型的結(jié)論[5-7]。從表2中可以發(fā)現(xiàn)，使用人類Rh及MN血型系統(tǒng)試劑對(duì)大熊貓紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)果全部呈陰性，與文獻(xiàn)報(bào)道的大熊貓具有M血型抗原物質(zhì)結(jié)論不一致[8]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明使用人類ABO、Rh及MN血型試劑無(wú)法對(duì)大熊貓紅細(xì)胞進(jìn)行定型。

在大熊貓血液與小鼠及人類血液交叉配血結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)，小鼠血漿對(duì)大熊貓紅細(xì)胞不具有反應(yīng)性(表3)；人類AB、O型多人份混合血漿與小鼠大熊貓紅細(xì)胞交叉配血中，呈現(xiàn)全部陽(yáng)性的血清學(xué)凝集格局(表3)，這一格局很顯然是由于種間抗體，而非血型抗體造成的。亞洲黑熊血漿與大熊貓紅細(xì)胞的反應(yīng)，表現(xiàn)出同一只熊貓與不同亞洲黑熊血漿凝集結(jié)果不同，不同亞洲黑熊血漿與大熊貓紅細(xì)胞凝集結(jié)果不同，說(shuō)明亞洲黑熊血漿與大熊貓紅細(xì)胞的凝集是由血型抗原抗體反應(yīng)造成的，而非種間抗原(表3)。這也進(jìn)一步解釋了在本實(shí)驗(yàn)中，使用單克隆抗-M抗體并沒(méi)有凝集發(fā)生(表2)，而文獻(xiàn)中使用人源性抗-M抗血清可引發(fā)大熊貓紅細(xì)胞凝集反應(yīng)，其原因是人源性抗血清中的種間抗體與大熊貓紅細(xì)胞發(fā)生了假凝集，導(dǎo)致對(duì)凝集的原因的錯(cuò)誤判斷[8]。

使用血型定型試劑對(duì)血型定型的原理是，抗體特異性識(shí)別血型抗原的糖蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)，如人類ABO血型系統(tǒng)的檢測(cè)試劑中，抗-A特異性識(shí)別抗原糖蛋白末端的N-乙酰半乳糖抗-B特異性識(shí)別抗原糖蛋白末端的半乳糖，由于很多哺乳動(dòng)物亦發(fā)現(xiàn)存在類似的結(jié)構(gòu)，如犬科(Canidae)及貓科(Felidae)動(dòng)物的血型系統(tǒng)中，血型抗原的物質(zhì)基礎(chǔ)仍然是唾液酸及巖藻糖修飾的糖蛋白[10]，故若大熊貓存在相應(yīng)類似結(jié)構(gòu)的抗原，使用類似的抗體存在鑒定出該抗原的可能性如果該抗體可以特異性識(shí)別。而在本研究中，小鼠源性的人類血型單克隆抗體無(wú)法檢測(cè)大熊貓紅細(xì)胞膜上的血型抗原蛋白，其原因有可能是由于大熊貓血型蛋白結(jié)構(gòu)與人類相差較大，導(dǎo)致專一識(shí)別人類血型抗原構(gòu)象無(wú)法識(shí)別大熊貓紅細(xì)胞血型抗原。

同時(shí)，從亞洲黑熊血漿與大熊貓紅細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，一部分亞洲黑熊可能與大熊貓血液配合，存在作為大熊貓異種輸血血液來(lái)源的可能性。

由于大熊貓紅細(xì)胞有限，本實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有使用針對(duì)同一抗原的不同細(xì)胞株的抗體對(duì)大熊貓紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，故大熊貓是否具有與人類血型抗原結(jié)構(gòu)相近似的血型抗原，都有待進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

在大熊貓輸血配合實(shí)驗(yàn)的定型中，由于種間抗體的干擾以及抗原結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)的不同造成的不識(shí)別，異源性單、多克隆抗體(人類血型分型試劑)不可作為大熊貓紅細(xì)胞分型試劑使用。歷史文獻(xiàn)中使用人類血型定型試劑對(duì)大熊貓紅細(xì)胞血型進(jìn)行檢測(cè)，由于無(wú)法排除檢測(cè)中因種間抗體引發(fā)的假陽(yáng)性結(jié)果，故其得出的大熊貓具有M抗原及大熊貓紅細(xì)胞分型類似人類O，Rh+型的結(jié)論不成立。