陳棟 李曉聰 魯方麗 王瑩瑩 李強(qiáng)

液泡分選蛋白成員(vacuolar protein sorting, VPS)參與調(diào)控多種細(xì)胞過(guò)程：包括細(xì)胞增殖[1]、自噬[2]和微衛(wèi)星不穩(wěn)定[3]等。研究證實(shí)，VPS4B在溶酶體降解、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、病毒出芽等過(guò)程起著重要作用[4]。目前對(duì)于該蛋白的研究主要集中在其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及耐藥的影響[5]，在牙齒發(fā)育過(guò)程中的作用鮮有報(bào)道。前期課題組收集到1 例河南遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良I型(dentin dysplasia type I, DD-I)家系，表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，患者均表現(xiàn)出牙冠形態(tài)、顏色正常，而牙根短小發(fā)育畸形，髓腔及根管部分閉鎖。通過(guò)對(duì)外周血進(jìn)行基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該家系患者中都存在VPS4B基因突變(IVS7+46C>G)[6]。自1973 年Shields[7]根據(jù)臨床及X線表現(xiàn)將此類(lèi)疾病分為牙本質(zhì)發(fā)育不全和牙本質(zhì)發(fā)育不良以來(lái)，已證實(shí)多種亞型均為DSPP基因突變所致，但在DD-I患者中未發(fā)現(xiàn)該基因突變，導(dǎo)致此亞類(lèi)的致病機(jī)制仍不明確。本研究擬通過(guò)觀察VPS4B在小鼠磨牙發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)與分布，初步探討其在牙齒發(fā)育過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、設(shè)備

8 周齡健康C57BL/6J雌鼠25 只雄鼠10 只(濟(jì)南朋悅)；檸檬酸抗原修復(fù)液、PBS、兔抗小鼠VPS4B抗體(博奧森)；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)，切片機(jī)(Leica，德國(guó)); 光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的制備 將c57雌雄小鼠以3∶1比例合籠，孕栓出現(xiàn)當(dāng)日中午定為胚胎發(fā)育第0.5天(E0.5)，新生鼠鼠齡計(jì)算以出生當(dāng)天中午定為出生后第0.5天(P0.5)。脫頸處死E13.5、E14.5、E16.5孕鼠及P2.5、P7幼鼠，取胎鼠頭部及幼鼠下頜骨組織，浸于4%多聚甲醛中于4 ℃下固定24 h，流水沖洗后脫水、透明、包埋，制備5 μm連續(xù)切片備用(其中新生幼鼠下頜骨固定后需先在10%EDTA溶液中脫鈣)。

1.2.2 組織學(xué)染色分析 采用HE染色，光鏡下觀察確定各時(shí)間點(diǎn)C57小鼠第一磨牙牙胚的發(fā)育時(shí)期。

1.2.3 免疫組化分析 采用SP法檢測(cè)小鼠牙胚中VPS4B表達(dá)。切片脫蠟至水，于枸櫞酸鹽緩沖液中高壓熱修復(fù)抗原， 3%的過(guò)氧化氫去離子水孵育15 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗5 min×3 次，100 g/L正常山羊血清室溫封閉30 min，傾去血清，滴加1∶100稀釋的VPS4B多克隆抗體，4 ℃濕盒過(guò)夜；復(fù)溫1 h， PBS漂洗5 min×3 次；滴加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3 次；滴加酶復(fù)合物，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3 次；光鏡控制下DAB室溫顯色，蘇木精復(fù)染；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片；顯微鏡觀察并攝片?？瞻讓?duì)照組用PBS代替一抗。

1.2.4 免疫組化結(jié)果判定 結(jié)果判定參考文獻(xiàn)[8]標(biāo)準(zhǔn)，①陰性表達(dá)：細(xì)胞內(nèi)無(wú)淡黃色及棕黃色顆粒，蘇木素復(fù)染后呈藍(lán)色；②弱陽(yáng)性表達(dá)：細(xì)胞內(nèi)淡黃色或陽(yáng)性著色低于該組織結(jié)構(gòu)的10%；③陽(yáng)性表達(dá)：細(xì)胞內(nèi)淡黃色或棕黃色顆粒占該組織結(jié)構(gòu)的10%～60%，染色清晰；④強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)：淡黃色或棕黃色顆粒占該組織結(jié)構(gòu)的60%以上，染色強(qiáng)。

2 結(jié) 果

VPS4B在小鼠E13.5至P7的下頜第一磨牙牙胚中均有表達(dá)，且在不同的發(fā)育階段其表達(dá)分布也不同。E13.5時(shí)，牙胚處于蕾狀期，牙板上皮細(xì)胞增生形成卵圓形上皮芽，其下方及周?chē)耐馀唛g葉細(xì)胞增生、密集包繞上皮芽，但未見(jiàn)細(xì)胞分化(圖 1A1)。此時(shí)VPS4B 在各細(xì)胞中均表達(dá)，且在上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，鄰近的間充質(zhì)細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)(圖 1A2～A3)。

E14.5小鼠第一磨牙牙胚處于帽狀期，HE染色牙胚由成釉器、牙乳頭和牙囊共同組成，成釉器分為外釉上皮層、內(nèi)釉上皮層和星網(wǎng)狀層3 層細(xì)胞，成釉器下方細(xì)胞凝集形成牙乳頭，包繞成釉器和牙乳頭邊緣的外胚間葉細(xì)胞形成牙囊(圖 1B1)。免疫組化示VPS4B在成釉器的內(nèi)釉上皮、外釉上皮呈強(qiáng)陽(yáng)性連續(xù)性表達(dá)，在星網(wǎng)狀層、牙乳頭和牙囊細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)(圖 1B2～B3) 。

E16.5胎鼠牙胚處于鐘狀早期，可見(jiàn)成釉器細(xì)胞由外釉上皮、內(nèi)釉上皮、星網(wǎng)狀層和中間層組成(圖 1C1)，并于內(nèi)外釉上皮交界處形成頸環(huán)。VPS4B表達(dá)在成釉器中強(qiáng)陽(yáng)性，牙乳頭和牙囊中陽(yáng)性表達(dá)(圖 1C2～C3)。

P2.5時(shí)，牙胚處于分泌期，HE染色示：牙冠未來(lái)形狀已確定，外釉上皮細(xì)胞退化，內(nèi)釉上皮分化為高柱狀成釉細(xì)胞，鄰近的牙乳頭細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞(圖 1D1)。VPS4B在成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，中間層、星網(wǎng)狀層和牙乳頭細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)，牙囊細(xì)胞中弱陽(yáng)性表達(dá)(圖 1D2～D3)。

P7時(shí)，小鼠牙齒基本形成，成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)蛋白礦化逐漸形成釉質(zhì)和牙本質(zhì)(圖 1E1)，VPS4B在成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中連續(xù)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，牙囊細(xì)胞中弱陽(yáng)性表達(dá)(圖 1E2～E3)。

3 討 論

牙齒的形成是一個(gè)連續(xù)、長(zhǎng)期、復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞分化、組織礦化和牙齒萌出，該過(guò)程是牙源性上皮細(xì)胞與顱神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞相互作用的結(jié)果。本課題組前期通過(guò)對(duì)一個(gè)遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不良家系的研究發(fā)現(xiàn)其突變基因?yàn)閂PS4B，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該基因幾乎表達(dá)于人體的所有組織中。此外通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)VPS4B基因轉(zhuǎn)錄水平提高后CHMP4BmRNA,WNT5AmRNA和β-cateninmRNA的轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)；反之VPS4B基因轉(zhuǎn)錄水平下降后，三者轉(zhuǎn)錄水平也隨之下調(diào)。因此推測(cè)VPS4B蛋白通過(guò)與CHMP4B結(jié)合調(diào)控Wnt通路[6]，進(jìn)而調(diào)節(jié)牙齒發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)并最終影響牙齒的發(fā)育。研究表明，VPS4B可在成牙髓干細(xì)胞系和牙齦成纖維細(xì)胞中表達(dá)[9]，但VPS4B在牙胚發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)特異性尚無(wú)報(bào)道。小鼠生長(zhǎng)周期快、成熟早、基因背景明確，因此我們選擇不同發(fā)育時(shí)期的小鼠下頜第一磨牙牙胚來(lái)研究VPS4B在牙胚發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況[10]。

通過(guò)HE及免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，小鼠牙胚處于蕾狀期時(shí)，細(xì)胞尚無(wú)分化，VPS4B在各細(xì)胞中均表達(dá)，且在上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。當(dāng)牙胚發(fā)育至帽狀期，VPS4B仍在各細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但成釉器中表達(dá)明顯強(qiáng)于牙乳頭和牙囊。鐘狀早期時(shí)，內(nèi)外釉上皮交界處形成頸環(huán)，成釉器和牙乳頭中VPS4B表達(dá)較帽狀期無(wú)差異，但牙囊中表達(dá)減弱。小鼠出生后牙胚依次經(jīng)歷分泌期和礦化期，此過(guò)程中成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中均可見(jiàn)高表達(dá)的VPS4B蛋白，其次在中間層、星網(wǎng)狀層和牙乳頭細(xì)胞中也呈陽(yáng)性表達(dá)，而牙囊細(xì)胞中表達(dá)漸弱。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在牙胚發(fā)育初期VPS4B在細(xì)胞中持續(xù)廣泛表達(dá)，隨發(fā)育的進(jìn)行，該蛋白在成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞均強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，但在牙囊中表達(dá)逐漸減弱。因此推測(cè)VPS4B的異常主要引起牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)發(fā)育異常，但對(duì)牙周組織影響較小。

圖 1 VPS4B在小鼠E13.5至P7的下頜第一磨牙牙胚中的表達(dá)

VPS4B作為多泡體(multivesicular bodies，MVBs)形成分泌的關(guān)鍵因素在細(xì)胞分裂、溶酶體降解和病毒感染外排的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。近年來(lái)VPS4B在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮的作用得到越來(lái)越多的關(guān)注和研究，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)VPS4B通過(guò)MVBs影響細(xì)胞生長(zhǎng)，可以參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路(MAPK/JNK、Notch、PI3K)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠影響細(xì)胞周期并參與癌細(xì)胞耐藥[12]。多項(xiàng)研究表明VPS4B可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖及凋亡，且不同疾病中其作用不一致[13]。在非小細(xì)胞肺癌、多發(fā)性骨髓瘤及相應(yīng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，VPS4B通過(guò)MAPK 通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過(guò)程即上調(diào) VPS4B 表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之則抑制細(xì)胞增殖活性[5,14]。在藥物誘導(dǎo)的克羅恩病模型及相應(yīng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，VPS4B通過(guò)p38 MAPK通路調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，VPS4B表達(dá)下調(diào)伴隨著凋亡效應(yīng)分子 CASP3、 PARP 蛋白表達(dá)量降低[15]；同樣在骨關(guān)節(jié)炎模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)VPS4B通過(guò)p38 MAPK通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[16]。由此說(shuō)明VPS4B通過(guò)MAPK通路實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的調(diào)控，而牙根的發(fā)育與上皮根鞘的完整形成、適時(shí)斷裂及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，異常的細(xì)胞形態(tài)將導(dǎo)致牙根畸形[17]。因此我們猜測(cè)突變的VPS4B基因通過(guò)MAPK通路調(diào)控上皮根鞘細(xì)胞增殖及凋亡，進(jìn)而影響牙根的形成，其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。本實(shí)驗(yàn)闡明了VPS4B蛋白在小鼠牙胚發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分布，為VPS4B的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)，同時(shí)也為牙齒發(fā)育研究提供了新線索。