陳銀燕 張瑜 柴治國 沈麗娟 邢曉東 肖玉鴻

復合樹脂以其美觀與功能兼優(yōu)的特點而被廣泛應用于口腔臨床牙體缺損修復中[1]，但是，復合樹脂較其它修復材料表面更易粘附細菌[2]，且繼發(fā)齲發(fā)生率高，易導致修復失敗[3]。因此，研發(fā)抗菌性樹脂材料是減少繼發(fā)齲發(fā)生、預防修復失敗的重要途徑[4]。大量研究報道將銀納米顆?；蚣句@鹽分別添加至樹脂中獲得抗菌性能[2,4]。單獨添加銀納米顆粒與樹脂基質(zhì)間無化學連接，僅簡單分散于樹脂基質(zhì)中，因此，釋出速率難以控制，抗菌活性隨時間而降低。同時，抗菌成分的釋出將影響載體材料的機械性能，且對周圍組織產(chǎn)生一系列副作用[5-6]。可聚合季銨鹽單體可與樹脂基質(zhì)成分發(fā)生聚合反應，形成化學結合[7]，因此，具有不易釋出及化學性能穩(wěn)定的特點，適量添加至樹脂中對載體材料的機械性能無顯著影響[8]，但有限的添加量限制了其抗菌活性，而添加量過大會導致化學結合不穩(wěn)定、影響載體材料整體性能及穩(wěn)定性等一系列問題的產(chǎn)生[9]。因此，兩類材料在抗菌時效、抗菌效率及對載體材料的影響等方面各有優(yōu)缺點，如何研發(fā)兼具兩者優(yōu)勢的復合抗菌材料逐漸成為了學者們關注的熱點。本課題組前期合成了一種新型雙重抗菌材料-季銨鹽包裹溴化銀納米復合物(AgBr/BHPVP)，兼具季銨鹽接觸抗菌及銀離子緩釋性能。本研究旨在通過將其添加至樹脂基質(zhì)中，綜合評價其固化后的抗菌及機械性能，優(yōu)選出改性樹脂基質(zhì)的AgBr/BHPVP最佳添加濃度，并驗證其雙重抗菌優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

AgBr/BHPVP(本課題組自制)；變形鏈球菌UA 159(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院微生物實驗室提供)；腦心浸出液肉湯(BHI，Oxoid 公司，英國)；人工唾液(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院藥劑科提供)；活/死菌染色試劑盒(L13152，美國)；Bis-GMA、TEGDMA、樟腦醌、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)(Sigma-Aldrich，美國)；超凈工作臺(HF safe-1200型，上海力申科學儀器有限公司)；厭氧培養(yǎng)罐(8525-A 型，沈陽)；Vitek細菌比濁儀(梅里埃公司，法國)；旋渦混合器(XW-80A型，江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)；微量加樣器(Eppendorf，德國)；24孔細胞培養(yǎng)板(Corning，美國)；激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)(FluoView FV1000,日本)；萬能材料試驗機(島津AGS-10kNG,日本)；顯微硬度計(HXD-1000TM，上海泰明光學儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 AgBr/BHPVP的合成 通過季銨化反應將溴己烷和2-溴乙基甲基丙烯酸酯接枝到聚-4乙烯吡啶 [poly(4-vinylpyridine)，PVP]側鏈上，合成季銨鹽甲基丙烯酸酯(quaternary ammonium methacrylates，BHPVP)。隨后，向聚合物中緩慢添加對甲苯磺酸銀(silver paratoluenesulfonate solution，AgPTS)，經(jīng)原位沉淀方法，AgBr以化學配位鍵方式結合于BHPVP側鏈上，被BHPVP聚合物包裹，通過空間位阻效應穩(wěn)定于該聚合物中。真空干燥24 h后得到AgBr/BHPVP(圖 1)。

1.2.2 實驗菌株培養(yǎng) 復蘇變形鏈球菌UA 159，于37 ℃厭氧培養(yǎng)罐(85%N2+5%CO2+10%H2)中培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于無菌BHI瓊脂平板上，培養(yǎng)24 h后，將菌懸液比濁至0.5 MAC，以BHI液(含0.2%蔗糖)將菌懸液稀釋100倍備用。

圖 1 AgBr/BHPVP結構圖

1.2.3 抗菌樹脂樣本制備 Bis-GMA與TEGDMA 以質(zhì)量比 1∶1 組成樹脂基質(zhì)，加入樟腦醌(引發(fā)劑)與DMAEMA(促進劑)各0.5%，磁力攪拌器混勻，避光狀態(tài)下將AgBr/BHPVP按0.5%、1.0%、1.5%質(zhì)量分數(shù)添加至樹脂基質(zhì)中作為改性組，未添加AgBr/BHPVP的樹脂基質(zhì)作為空白對照組，根據(jù)前期熱重分析結果，同時設置3 個中間對照組：0.13%AgBr(MA)、0.87%BHPVP(MB)、0.13%AgBr+0.87%BHPVP(MA+B)組，抽真空排氣泡避光保存?zhèn)溆?。分組配制后將樹脂充填于內(nèi)徑10 mm、高1.5 mm 的聚四氟乙烯模具中，覆蓋聚乙烯薄膜，光固化。經(jīng)水砂紙逐級打磨拋光后置37 ℃去離子水中浸泡24 h。老化3 個月樣本浸泡于人工唾液中(含0.3 mmol/L疊氮化鈉，以保證樹脂試件表面不被細菌污染)老化處理3 個月，期間，37 ℃水浴，每2 d更換1 次人工唾液。每組每個時間點樣本5 個，實驗前以70%乙醇擦拭試件表面，無菌水沖洗，環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.2.5 CLSM觀察細菌活性 老化處理前后樣本與變形鏈球菌菌懸液共培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，PBS緩沖液輕柔漂洗3 次，活/死菌試劑避光染色15 min，PBS再次漂洗，樣本置CLSM下觀察細菌活性。

1.2.6 機械性能檢測

1.2.6.1 撓曲強度檢測 根據(jù)ISO 4049標準，制作規(guī)格為25 mm×2 mm×2 mm的樹脂試件，空白對照組、0.5%、1.0%、1.5%AgBr/BHPVP改性組每組9 個，光固化后，經(jīng)600 目水砂紙打磨拋光，置37 ℃恒溫水浴24 h。精確測量各試件的寬(w)和高(h)后，于萬能試驗機進行撓曲強度測試，測試速度1 mm/min，記錄破壞載荷(F)，按照以下公式計算撓曲強度(flexural strength, FS)：FS=3FL/2wh2，其中L=20 mm, 為下加荷臺支點間距離。

1.2.6.2 維氏顯微硬度檢測 制備直徑 6 mm、高3 mm的圓柱形樹脂試件，空白對照組、0.5%、1.0%、1.5%AgBr/BHPVP改性組每組9 個，光固化后，水砂紙逐級打磨，表面拋光呈鏡面，置37 ℃恒溫水浴24 h。于維氏顯微硬度計上以25 g載荷對樣本表面加載15 s，測試維氏顯微硬度值。每個試件隨機測試3 個點，計算均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件，單因素方差分析比較不同組間總體差異，采用 LSD(方差齊) 及Dunnett’s T3(方差不齊)法進行組間兩兩比較。檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結 果

2.1 樹脂試件CFU計數(shù)

各組樹脂試件表面CFU計數(shù)見圖 2。老化處理前后，0.5%、1.0%、1.5%AgBr/BHPVP改性組樹脂試件表面CFU均較空白對照組顯著降低(P<0.05)；老化3 月1.0%、1.5%組間CFU無顯著差異(P>0.05)，此外，老化處理前或處理后試件表面CFU均隨AgBr/BHPVP添加量增加而減少(P<0.05)；老化處理3 月后， 0.5%、1.5%改性組CFU數(shù)量較同組別老化處理前顯著增加(P<0.05)，1.0%改性組老化處理前后CFU數(shù)量間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖 2A)。老化處理前，MA組與MB組CFU均顯著高于1.0% AgBr/BHPVP組(P<0.05)，MA+B組與1.0% AgBr/BHPVP組之間CFU無顯著差異(P>0.05)；老化處理后，MA、 MB、MA+B組CFU數(shù)量均顯著高于1.0%AgBr/BHPVP組(P<0.05)(圖 2B)。

2.2 CLSM觀察

如圖 3所示，其中活菌染成綠色，死菌染成紅色，接近或重疊的活、死菌呈現(xiàn)橙或黃色?？瞻讓φ战M樹脂試件表面覆蓋大量活細菌，呈大片綠色熒光；改性組樹脂試件表面綠色熒光減少，紅色熒光增多，即改性組樹脂試件表面黏附的活菌量明顯少于空白對照組。

2.3 機械性能的比較

各組樹脂試件撓曲強度及維氏顯微硬度的比較見圖 4。0.5%、1.0%改性組樹脂試件撓曲強度值與空白對照組比較無顯著差異(P>0.05)，當AgBr/BHPVP添加量為1.5%時，撓曲強度值較空白對照組顯著降低(P<0.05)?？瞻讓φ战M與改性組樹脂試件維氏顯微硬度值均無顯著性差異(P>0.05)。

圖 2 各組樹脂試件CFU的比較

3 討 論

新合成的復合抗菌材料-AgBr/BHPVP引入了丙烯酸酯功能基團，在賦予其季銨鹽接觸抗菌及緩釋銀離子雙重抗菌性能的同時，將其添加至樹脂體系中能與樹脂基質(zhì)進行化學結合，發(fā)揮穩(wěn)定、持續(xù)抗菌作用，適量添加對載體材料的機械性能無顯著影響。

季銨鹽類抗菌劑以“接觸抗菌”發(fā)揮抗菌作用[10]，帶正電荷的N+吸引帶負電荷的細菌細胞膜，通過表面離子與疏水作用與細胞膜表面相互作用，擾亂細胞膜表面電荷分布，導致胞膜穿孔，細胞內(nèi)容物泄露[11]。銀離子主要通過配合供電子基團協(xié)同破壞細菌關鍵細胞酶及DNA的活性，使其變性，并可與細菌細胞壁肽聚糖相互作用，導致細胞結構改變，細胞壁內(nèi)陷，滲透壓增高，最終細胞死亡[12-14]?？谇粌?nèi)定植的菌種眾多，其中變形鏈球菌是導致齲病發(fā)生的主要病原菌[15]，因此，本實驗中選取該菌用以測試改性樹脂基質(zhì)的抗菌活性。從樹脂對變形鏈球菌 UA 159的抗菌活性結果可以看出，老化處理前后改性組試件表面CFU均顯著低于空白對照組(P<0.05)。老化3 月后，0.5%、1.5%改性組CFU數(shù)量均較同組別老化前增多(P<0.05)，而1.0%改性組老化3 月后試件表面CFU較老化處理前無顯著差異(P>0.05)，從而優(yōu)選出AgBr/BHPVP添加于樹脂基質(zhì)的適宜濃度。而后，根據(jù)前期熱重分析結果，AgBr/BHPVP中AgBr質(zhì)量約占13%，故設立0.13%AgBr、0.87%BHPVP、0.13%AgBr+0.87%BHPVP 3 個中間對照組，與優(yōu)選出的1.0%AgBr/BHPVP組進行比較，進一步行老化前后對變形鏈球菌的抗菌實驗。結果顯示，除老化處理前0.13%AgBr+0.87%BHPVP 組與1.0%AgBr/BHPVP組CFU數(shù)量無顯著差異(P>0.05)外，1.0%AgBr/BHPVP組老化處理前后CFU均顯著低于各中間對照組(P<0.05)。故AgBr/BHPVP改性樹脂基質(zhì)表現(xiàn)出良好的抗菌長效性。前期實驗研究已證實AgBr/BHPVP可緩慢釋放銀離子，單體具備抗菌長效性，結合此實驗結果，可進一步說明AgBr/BHPVP添加至樹脂基質(zhì)中固化后，亦賦予載體材料持續(xù)、穩(wěn)定、長效的抗菌性能，其抗菌性能優(yōu)于單獨添加AgBr或BHPVP，以及將AgBr與BHPVP同時混合添加入樹脂基質(zhì)中。

圖 3 激光共聚焦顯微鏡觀察各組樹脂試件表面黏附的變形鏈球菌 (CLSM, ×40)

Fig 3 CLSM observation of S.mutans on the surface of resin specimens (CLSM, ×40)

圖 4 AgBr/BHPVP改性樹脂基質(zhì)機械性能的比較

Fig 4 Comparison of mechanical properties of AgBr/BHPVP modified resin matrix

樹脂修復材料在口內(nèi)行使功能時遇到的兩大挑戰(zhàn)分別是繼發(fā)齲和修復體折裂[16]。因此，除具備抗菌活性以外，材料自身剛度需達到一定程度才能保障其在口腔中良好地行使功能。撓曲強度測試相比壓縮強度測試，前者對材料亞結構的輕微變化敏感性更高[17]，故本實驗選用撓曲強度作為評價改性后樹脂基質(zhì)機械性能的指標之一。該實驗中，當樹脂基質(zhì)中AgBr/BHPVP添加量為0.5%、1.0%時，撓曲強度與空白對照組間無顯著性差異(P>0.05)，且其撓曲強度值均位于80 MPa以上，符合ISO 4049標準要求[18]。但當添加量達1.5%時，撓曲強度下降，與空白對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。其原因可能在于樹脂體系中過量AgBr/BHPVP與樹脂基質(zhì)間無法形成化學結合，從而形成不良接觸界面，孔隙增加，受力時易導致應力集中，材料整體強度降低。硬度是衡量材料軟硬程度的指標，常被用以表征材料的耐磨損性能。臨床上常用的Bis-GMA和TEGDMA純樹脂基質(zhì)的其維氏顯微硬度值介于100～200 MPa[19]，本研究中實驗結果顯示，利用AgBr/BHPVP對樹脂基質(zhì)進行改性，各組維氏顯微硬度值均高于100 MPa，與空白對照組接近，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

綜上所述，經(jīng)適量AgBr/BHPVP改性的樹脂基質(zhì)在體外對變形鏈球菌具有持續(xù)、穩(wěn)定、長效的抗菌活性，當添加量為1.0%時，老化處理前后均表現(xiàn)出良好的抗菌活性，對材料的撓曲強度及維氏顯微硬度無不利影響，在口腔修復材料領域有良好應用前景。