張立國,李彥霖,班巧英*,李建政

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qPCR揭示丙酸降解菌群隨OLR提高的演替規(guī)律

張立國1,李彥霖1,班巧英1*,李建政2

(1.山西大學環(huán)境與資源學院,山西 太原 030006；2.哈爾濱工業(yè)大學市政與環(huán)境工程學院,黑龍江 哈爾濱 150090)

為探討有機負荷率(OLR)對升流式厭氧污泥床(UASB)反應器運行效能的影響及互營丙酸降解菌群的響應,以稀釋的制糖廢水為底物,考察了OLR升高對UASB處理效能的影響,并采用實時熒光定量PCR技術(qPCR)分析了互營丙酸降解菌群隨OLR提高的演替規(guī)律.結果表明,在OLR為6.0~54.0kgCOD/(m3·d)的范圍內(nèi),UASB處理制糖廢水取得了良好的效果,其COD去除率為92.0%以上.qPCR檢測結果表明,至少有3種已鑒定的丙酸氧化菌(,和)存在于UASB反應器中.其中,是主要的丙酸氧化菌,其數(shù)量為126~1.2×10316S rRNA 基因拷貝數(shù)/ng DNA,約占檢測到丙酸氧化菌總數(shù)的47.9%~58.6%. OLR從6.0提高至54.0kgCOD/(m3·d)導致所有丙酸氧化菌數(shù)量顯著減少和是該UASB系統(tǒng)中的主要氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌.與丙酸氧化菌的變化趨勢相反,這兩種產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量均隨OLR的提高而顯著增加,并在OLR54.0kgCOD/(m3·d)條件下達到最大值.

升流式厭氧污泥床；有機負荷率；丙酸氧化菌；產(chǎn)甲烷菌；熒光定量PCR

厭氧生物處理技術廣泛用于處理各種有機廢棄物,同時回收甲烷作為清潔能源[1-3].有機物的厭氧生物處理過程包括4個步驟:水解發(fā)酵、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸、同型產(chǎn)乙酸和產(chǎn)甲烷作用.這4個步驟的代謝平衡是保證厭氧反應器高效運行的關鍵因素[4].然而,當系統(tǒng)遭受溫度、有機負荷率、毒性物質(zhì)等沖擊時,以上4個步驟將變得不平衡,從而導致?lián)]發(fā)酸大量積累,進而使得系統(tǒng)運行失敗[5-6].在這些積累的揮發(fā)酸中,丙酸通常占有較大比重,主要是由于丙酸的厭氧降解是一個高度吸能的過程,很難自發(fā)進行.此外,丙酸降解還需要產(chǎn)甲烷菌或其他耗氫菌的協(xié)同作用,所以其伴生菌的活性和數(shù)量對丙酸降解也有一定影響.

在產(chǎn)甲烷環(huán)境中,丙酸的降解是通過丙酸氧化菌和產(chǎn)甲烷菌的互營協(xié)作來完成的,其在有機物厭氧降解過程中起著重要的作用[7].一方面丙酸氧化菌將丙酸轉化為乙酸和H2/CO2,為產(chǎn)甲烷菌提供底物;另一方面產(chǎn)甲烷菌通過消耗乙酸和H2/CO2,為丙酸氧化菌解除產(chǎn)物的反饋抑制作用,同時為丙酸氧化菌提供能量.丙酸氧化菌的這種代謝方式使其分離培養(yǎng)十分困難,導致只有少數(shù)丙酸氧化菌被分離和鑒定[5].從系統(tǒng)發(fā)育關系看,已鑒定的丙酸氧化菌主要分布在變形菌門(Proteobacteria)的屬和屬中,以及厚壁菌門(Firmicutes)中低G+C含量、革蘭氏陽性菌的屬和屬中[5].丙酸氧化菌存在于各種厭氧生境中[8-10].它們的組成和分布受到諸多因素的影響,包括丙酸濃度,溫度,pH值等[11-13].

盡管關于丙酸氧化菌定性和定量分析的研究已有報道.然而,不同運行條件下互營丙酸氧化菌群定量分析的相關報道仍然較少.前期研究發(fā)現(xiàn),在處理制糖廢水的UASB反應器中,和是主要的丙酸氧化菌,而和是主要的產(chǎn)甲烷菌[14].因此,本研究針對這4個屬中已鑒定的丙酸氧化菌和產(chǎn)甲烷菌,采用實時熒光定量PCR技術(qPCR)分析其隨有機負荷率(OLR)提高的演替規(guī)律,為強化反應器運行效能及穩(wěn)定性提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 反應器運行控制

試驗裝置為UASB反應器,其有效容積為11L.試驗廢水為稀釋的制糖廢水,添加尿素和KH2PO4使得廢水的COD:N:P為200~300:5:1,并補充微生物生長所必須的微量元素及維生素等[15].在溫度(35±1)℃,水力停留時間(HRT)24h,進水COD為1000mg/L, pH值為6.8~7.2條件下啟動UASB反應器,然后將UASB的HRT逐漸縮短至8h.待運行穩(wěn)定后,保持HRT為8h,將進水COD逐漸增加至 2000,4000,8000,12000, 18000mg/L,使得反應器的OLR分別為6.0(15d)、12.0(13d),24.0(19d),36.0(21d),54.0kg/(m3?d)(31d).每次改變OLR均在前一次運行達到穩(wěn)定時進行.每次運行達到穩(wěn)定后從污泥床取樣,保存至-20℃?zhèn)溆?

1.2 分析項目及方法

pH值和生物量采用標準方法測定[16],產(chǎn)氣量通過濕式氣體流量計(LML-1,長春汽車濾清器有限責任公司)測定,氣體組成和揮發(fā)酸組成采用氣相色譜儀測定(SP-6800A和SP6890,山東魯南瑞虹化工儀器有限公司).

1.3 DNA提取及qPCR

稱取0.15g污泥(濕重),采用DNA提取試劑盒(MO Bio Laboratories,Inc,Carlsbad,CA,USA)提取厭氧活性污泥總DNA.DNA濃度用分光光度計測定(Thermo Fisher Scientific Inc.USA).

根據(jù)和中已鑒定物種的16S rRNA基因序列設計特異引物,引物序列見表1[13].qPCR分析采用絕對定量方式.標準樣品為包含目的基因片段融合質(zhì)粒,用超純水進行10倍梯度稀釋(101~107).標準樣品和待測樣品同時進行qPCR分析. qPCR在熒光定量PCR系統(tǒng)(7500型, ABI, USA)中完成.所用熒光染料為SYBR green I.反應體系為: SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo Co.,LTD., Japan)10μL,DNA樣品3μL,引物各1μL, ROX 0.04μL, 4.96μL H2O.反應程序: 94℃預變性1min,94℃ 15s, 58℃30s,72℃ 35s,40循環(huán).每個樣品設置3個重復.以達到對數(shù)增長時的循環(huán)數(shù)(C值)為橫坐標,標準質(zhì)粒數(shù)目的對數(shù)值為縱坐標繪制標準曲線(圖1).

表1 qPCR中所用引物序列

圖1 qPCR中丙酸氧化菌和產(chǎn)甲烷菌標準曲線

2 結果與討論

2.1 UASB運行效能

在35℃、HRT8h條件下,考察了OLR提高對UASB反應器運行效能的影響.結果表明,在OLR為6.0~54.0kgCOD/(m3·d) 條件下,COD去除率高達92.0%以上(表2).當OLR分階段從6.0逐漸提高至54.0kgCOD/ (m3·d)時,出水揮發(fā)酸濃度提高了0.6~3.8倍.當OLR為6.0kgCOD/(m3·d)時,出水中乙酸和丙酸含量相當,分別為47.5,46.0mg/L.然而,有機負荷率的提高使得丙酸含量在總揮發(fā)酸中比例提高到55.2%~ 62.4%之間.隨著有機負荷率的不斷提升,UASB的生物量和比產(chǎn)甲烷速率也逐漸增加.以前的研究表明,當UASB處理水葫蘆汁液和乙酰氨基苯璜酰氯(p-ASC)生產(chǎn)廢水時的最佳OLR分別為8.9,7.0kgCOD/ (m3·d),其COD去除率可達到86.6%和100%[17-18].

表2 不同OLR條件下UASB反應器運行特征

2.2 丙酸氧化菌的qPCR分析

厭氧生物處理反應器的運行效能與系統(tǒng)中的微生物群落結構密切相關.前期研究發(fā)現(xiàn)該UASB中的主要丙酸氧化菌在分類學上屬于屬和屬[14].因此,本研究針對上述2個屬中已鑒定的丙酸氧化菌,通過qPCR探討了UASB反應器在OLR為6.0,12.0,24.0,36.0, 54.0kgCOD/(m3·d)條件下丙酸氧化菌的數(shù)量.結果表明,有3種已鑒定丙酸氧化菌存在于所有檢測的樣品中,分別是、和(圖2)其中,和是2個專性互營菌,只有與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)時才能生長[5].而除了能與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)外,還能在一些簡單底物上進行純培養(yǎng)[5].它們通過甲基丙二酰-輔酶A途徑(MMC)降解丙酸[19-21].

圖2 不同OLR條件下丙酸氧化菌定量分析

丙酸氧化菌的qPCR分析表明,當OLR為6.0kgCOD/(m3·d)時,、和的含量分別為:355,681,1.2×103個16S rRNA 基因拷貝數(shù)/ng DNA.和是該條件下的主要丙酸氧化菌,二者總數(shù)為1.9×10316S rRNA基因拷貝數(shù)/ng DNA,占檢測到丙酸氧化菌總數(shù)的84.3%(圖2和圖3).由圖2可知,隨著OLR分階段提高至54.0kgCOD/ (m3·d),所有檢測到丙酸氧化菌的數(shù)量逐漸減少.但是從表2可以看出,出水丙酸發(fā)生了一定程度的積累,但并不顯著.分析認為,這可能是由于產(chǎn)酸發(fā)酵階段沒有產(chǎn)生大量的丙酸,使得丙酸氧化菌可利用的底物減少,進而導致丙酸氧化菌數(shù)量的減少.

圖3 不同OLR條件下丙酸氧化菌的相對豐度

另外,本研究發(fā)現(xiàn),在OLR 6.0~54.0kgCOD/ (m3·d)條件下,是UASB反應器中的優(yōu)勢丙酸氧化菌,其相對豐度為47.9%~58.6%.類似地,也有研究發(fā)現(xiàn),在處理全脂奶粉、蔗糖、混合酸(丁酸、丙酸、乙酸)廢水時,或是優(yōu)勢丙酸氧化菌[10-11].然而,Shigematsu等的研究發(fā)現(xiàn),在一個以丙酸為唯一碳源的恒化器中,高稀釋率促進生長,而低稀釋率有利于的生長[22].

2.3 產(chǎn)甲烷菌的qPCR分析

作為有機物厭氧消化的最后一步,高效的產(chǎn)甲烷作用對于維持厭氧消化系統(tǒng)的效能是至關重要的.因此,本研究也考察了不同OLR條件下產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量.如圖4所示,本研究檢測到兩種產(chǎn)甲烷菌,它們是和為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌,可利用H2/CO2和甲酸進行生長代謝[23].而只能利用乙酸進行生長代謝、產(chǎn)甲烷,它可以利用濃度低至5~20μmol/L的乙酸[21].以前的研究表明,在含有顆粒污泥反應器中,是主要的乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌,它們能夠促進污泥顆?；痆23-25].

qPCR分析表明,兩種產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量均隨OLR的提高而顯著增加.在OLR為6.0kgCOD/(m3·d)條件下,的數(shù)量僅為889個16S rRNA 基因拷貝數(shù)/ng DNA.當OLR分階段提高至12.0,24.0,36.0, 54.0kgCOD/(m3·d)時,的數(shù)量增加了3.3~ 101倍,并在最后一個運行階段達到最大值(9.1×104個16S rRNA基因拷貝數(shù)/ng DNA).類似地,的數(shù)量也隨OLR的提高而不斷增加.在OLR為6.0,12.0,24.0,36.0,54.0kgCOD/(m3·d)條件下,的數(shù)量分別為2.6×104,1.9×105,5.0×105, 7.5×105,1.8×106個16S rRNA基因拷貝數(shù)/ng DNA.乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的增加使得該反應器出水乙酸濃度低于150mg/L(表2).產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的增加主要是由于產(chǎn)甲烷菌的底物隨有機負荷率不斷提高而增加所致.

盡管氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量表現(xiàn)出了相同的變化趨勢,但是后者的數(shù)量總是比前者高出2個數(shù)量級,說明乙酸裂解可能是該系統(tǒng)中主要的產(chǎn)甲烷途徑.以前的研究也表明,大約2/3的甲烷來自乙酸途徑[21].另外,本研究還發(fā)現(xiàn),當OLR￡24.0kgCOD/(m3·d)時,乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的增加幅度高于氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌,其相對豐度從96.7%增加至99.2%.但繼續(xù)提高負荷導致乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的相對豐度從99.2%降低至95.1%,說明較高的負荷(336.0kgCOD/(m3·d))對乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長產(chǎn)生了一定程度的抑制.研究還表明,高濃度氨氮(33.5g/L)可對乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷路徑產(chǎn)生顯著的抑制作用[26-27].本研究中,UASB反應器中的氨氮濃度總是低于100mg/L,所以并沒有抑制產(chǎn)甲烷作用.

以上結果表明,OLR提高并沒有使丙酸氧化菌和產(chǎn)甲烷菌的組成發(fā)生改變,但卻導致它們的數(shù)量發(fā)生了明顯變化.丙酸氧化菌的數(shù)量隨OLR的提高而降低,而產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量卻隨OLR的提高而增加.

3 結論

3.1 在35℃、HRT8h條件下,當OLR從6.0kgCOD/ (m3·d)分階段提高至54.0kgCOD/(m3·d)時,UASB系統(tǒng)的COD去除率高達92.0%以上,比產(chǎn)甲烷速率從130.5LCH4/(kg COD·d)增加至827.6LCH4/(kg COD·d).

3.2 在OLR 6.0kgCOD/(m3·d)條件下,、和的數(shù)量分別為:355、681和1.2×103個16S rRNA 基因拷貝數(shù)/ng DNA.它們的數(shù)量隨OLR的提高而逐漸減少,這可能是由于產(chǎn)酸發(fā)酵階段的發(fā)酵類型改變而導致的.

3.3 隨著OLR逐漸提高,產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量顯著增加.在OLR為54.0kgCOD/(m3·d)條件下,和的數(shù)量達到最大值,分別為:9.1×104和1.8×106個16S rRNA基因拷貝數(shù)/ng DNA.

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qPCR reveals the succession of syntrophic propionate-degrading consortia with OLR increase.

ZHANG Li-guo1, LI Yan-lin1, BAN Qiao-ying1*, LI Jian-zheng2

(1.College of Environment and Resource, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)., 2018,38(8)：2997~3002

To reveal the effects of organic loading rate (OLR) on the performance of upflow anaerobic sludge bed (UASB) reactor and syntrophic propionate-degrading consortia, this study investigated the effects of OLR increase on the treatment efficiency of UASB containing sugar refinery wastewater as substrate. The succession of syntrophic propionate-degrading consortia as OLR increasing was analyzed by quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction (qPCR). The results showed that the COD removal reached above 92.0% in UASB at OLR of 6.0~54.0kgCOD/(m3·d) conditions. qPCR explored that at least three identified species of propionate-oxidizing bacteria (,, and) existed in the UASB system.was dominated in UASB and its quantity was 126~1.2×10316S rDNA copies per ng DNA, accounting for 47.9%~58.6% of the total detectable propionate-oxidizing bacteria. OLR increase from 6.0 to 54.0kgCOD/(m3·d) resulted in all detected propionate-oxidizing bacteria significantly decreased. In addition,andwere the dominant hydrogenotrophic methanogens and acetotrophic methanogens. The number of methanogens was significantly increased with OLR increase and achieved a maximum at OLR of 54.0kgCOD/(m3·d) condition.

upflow anaerobic sludge bed；organic loading rate；propionate-oxidizing bacteria；methnaogens；qPCR

X703.5

A

1000-6923(2018)08-2997-06

張立國(1980-),男,河南安陽人,副教授,博士,主要從事廢水厭氧生物處理研究.發(fā)表論文20余篇.

2018-01-18

國家自然科學基金(51708341);山西省“青年三晉學者”支持計劃;山西省高等學校優(yōu)秀創(chuàng)新團隊支持計劃

* 責任作者, 講師, banqiaoying@163.com