張 哲， 李新圃， 楊 峰， 羅金印， 劉龍海， 李宏勝

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,以下簡稱金葡菌)是人和動(dòng)物最主要的致病菌之一，在自然界中分布極為廣泛[1-2]。金葡菌之所以難以防治，是因?yàn)樵诰w的表面存在一層“保護(hù)膜”，即莢膜(Capsule)。有研究表明，莢膜幾乎存在于所有金葡菌菌株的表面，可保護(hù)細(xì)菌免受抑菌或殺菌物質(zhì)的損害以及宿主吞噬細(xì)胞的吞噬，同時(shí)還有助于細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞表面以誘發(fā)感染，是細(xì)菌得以生存的重要表面結(jié)構(gòu)[3]。莢膜的主要成分為多糖，是細(xì)菌結(jié)構(gòu)變化最少的表面抗原，有較好的免疫原性，最適宜做疫苗的靶抗原之一[4]?，F(xiàn)已證明，金葡菌莢膜基因的表達(dá)受生長環(huán)境，如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等因素的影響，適宜的生長條件可提高菌體及莢膜多糖的產(chǎn)量[5-6]。為此，本研究選取了4種培養(yǎng)基(THB肉湯、哥倫比亞液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯和腦心浸出液)，在相同培養(yǎng)條件下，以菌液吸光度、菌體濕重等為指標(biāo)，確定最適金葡菌生長的培養(yǎng)基；并通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化等，對培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基初始pH、裝液量、接種量及培養(yǎng)溫度等進(jìn)行探究，以篩選出最適宜金葡菌的生長條件，并通過透射電鏡對優(yōu)化前后培養(yǎng)細(xì)菌的莢膜進(jìn)行比較觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌J581，為本實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定并凍存的奶牛乳房炎病原菌強(qiáng)毒株。

1.1.2 培養(yǎng)基 血瓊脂培養(yǎng)基，為廣州市迪景微生物科技有限公司生產(chǎn)；腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion Medium, BHI)、營養(yǎng)肉湯(Nutrient Broth, NB)均為廣州環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn)；哥倫比亞培養(yǎng)基(Columbia Broth, CB)購自招遠(yuǎn)托普生物工程有限公司；Todd-Hewitt Broth(THB)為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 主要試劑及儀器 新生牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)，戊二醛固定液(Sigma)及乳清(實(shí)驗(yàn)室自制)等；透射電鏡(JEM-1230，JEOL)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的篩選 開啟凍存的菌種J581，以1%的接種量接種至2 mL營養(yǎng)肉湯管中，37 ℃培養(yǎng)10 h制備一級(jí)種子發(fā)酵液；取0.3 mL一級(jí)種子液接種于裝有30 mL營養(yǎng)肉湯的三角錐瓶中，恒溫?fù)u床(37 ℃、120 r/min)培養(yǎng)至12 h得二級(jí)種子發(fā)酵液，短期置4 ℃冷藏備用。按1%的接種量將二級(jí)種子液分別接種于含500 mL THB、CB、NB及BHI液體培養(yǎng)基中，混勻后各取150 mL，分裝至5個(gè)100 mL滅菌搖瓶中(每種培養(yǎng)液含1瓶350 mL和5瓶30 mL)。所有搖瓶均置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)至28 h(37 ℃、120 r/min)。每隔4 h從350 mL搖瓶中取樣5 mL，采用pH計(jì)測定菌液pH值；取樣3 mL，測定600 nm處的吸光度；取樣1 mL進(jìn)行稀釋，并采用軟件計(jì)數(shù)法[7]對平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。分別在0、8、16、24及28 h于5個(gè)含30 mL的三角瓶中取15 mL置于離心管中，低溫離心后菌體稱重。

1.2.2 培養(yǎng)基外加營養(yǎng)成分的篩選 經(jīng)過對4種培養(yǎng)基的篩選比較，哥倫比亞培養(yǎng)基(CB)最適于金葡菌J581的生長。為進(jìn)一步優(yōu)化CB，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6,8-10]，在CB中分別添加葡萄糖、乳糖、乳清和血清，通過測定菌液的吸光度、活菌數(shù)及菌體產(chǎn)量，確定適宜的外加營養(yǎng)成分。按照步驟1.2.1中方法制備種子發(fā)酵液，以1%的接種量分別接種到添加有1%葡萄糖、1%乳糖、1%乳清和1%血清的CB中，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)至16 h；以CB為參比，測定OD600，采用CB稀釋至10-7，取200 μL涂布計(jì)數(shù)，離心收集菌體，稱量菌體濕重。

1.2.3 培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn) 采用優(yōu)選的培養(yǎng)基(CB)，對不同的裝液量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速以及1.2.2中優(yōu)選的營養(yǎng)成分(乳清)添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，各因素水平選擇見表1。除各因素變量外，初始培養(yǎng)條件為裝液量30%(體積分?jǐn)?shù))，接種量1%(體積分?jǐn)?shù))，乳清添加量1%(體積分?jǐn)?shù))，初始pH 7.0(高壓滅菌前)，37 ℃、120 r/min搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)至16 h，測定OD600，離心收集菌體，稱量菌體濕重。

表1 培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

1.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以起始pH、接種量、發(fā)酵溫度及乳清添加量為試驗(yàn)考察對象，以菌體濕重為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì) L9(34)正交表，其因素水平見表2。

表2 L9(34)正交設(shè)計(jì)編碼值及水平

1.2.5 菌體的電鏡觀察 金葡菌分別按照優(yōu)化前后的條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)至12 h，各取1.5 mL金

葡菌發(fā)酵液，8 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入2.5%的戊二醛固定，送至蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡中心做透射電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的篩選

經(jīng)過對4種培養(yǎng)基(THB、CB、NB和BHI)的pH值、吸光度及菌體濕重等相關(guān)指標(biāo)的測定，繪制各指標(biāo)隨培養(yǎng)時(shí)間變化的曲線(圖1)，綜合分析表明，相同培養(yǎng)條件下，哥倫比亞培養(yǎng)基(CB)最適于金葡菌J581的生長，確定16 h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。利用CB發(fā)酵金葡菌，其菌體產(chǎn)量(0.215 g/15 mL)是NB培養(yǎng)菌體產(chǎn)量(0.142 g/15 mL)的1.5倍。

圖1 不同培養(yǎng)基的pH值變化曲線圖(A)、活菌數(shù)變化曲線(B)、吸光度變化曲線(C)、菌體濕重變化曲線(D)Fig.1 Variation curves of pH(A), colony-forming units (B), absorbance (C), and bacterial weight in different medium(D)

2.2 外加營養(yǎng)成分的篩選

通過測定培養(yǎng)至16 h菌液的活菌數(shù)、菌體濕重及OD600，得到添加不同營養(yǎng)成分對細(xì)菌生長的影響，如圖2所示。由圖2可知，與其他營養(yǎng)成分相比，在CB中添加乳清，更有利于金葡菌的生長。

2.3 培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

通過測定菌體濕重及600 nm處的吸光度，得到不同裝液量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速及乳清添加量對細(xì)菌生長的影響，如圖3所示。結(jié)果表明，搖瓶裝液量越少，轉(zhuǎn)速越高，菌體生長狀況越好。但結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，裝液量過少將導(dǎo)致資源的浪費(fèi)，確定30%的裝液量為最佳；而轉(zhuǎn)速過高，可能導(dǎo)致?lián)u瓶被晃出，帶來安全隱患，因此確定200 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。考慮到各培養(yǎng)條件間可能存在的相互作用，對菌液起始pH、接種量、發(fā)酵溫度及乳清添加量，還需進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 外加營養(yǎng)成分的篩選Fig.2 Screening of nutrient components

圖3 裝液量(A)、pH(B)、接種量(C)、發(fā)酵溫度(D)、轉(zhuǎn)速(E)及乳清添加量(F)對細(xì)菌的影響Fig.3 Effect of liquid medium volume (A), pH (B), inoculation amount (C), fermentation temperature (D) shaking speed (E) and addition of whey (F) on growth of bacteria

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件及驗(yàn)證

對起始pH、接種量、發(fā)酵溫度及乳清添加量的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。從表3可以看出，各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度大小為發(fā)酵溫度>初始pH>乳清添加量>接種量。綜合來看，優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案為A2B2C2D2，即高壓滅菌前調(diào)pH至7.0，添加2%的乳清，接種量為1%，37 ℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)。因正交試驗(yàn)組合中無此組合，故需照此條件做一個(gè)補(bǔ)充驗(yàn)證性試驗(yàn)。結(jié)果表明，該優(yōu)選方案每15 mL菌液獲得0.258 g濕菌體，優(yōu)于9號(hào)實(shí)驗(yàn)方案(0.242 g)，與優(yōu)化前(0.215 g)相比，菌體產(chǎn)量提高了20%。

2.5 菌體的透射電鏡圖像

將菌體在透射電鏡做50 000倍放大，結(jié)果如圖4所示，其中A為優(yōu)化前條件培養(yǎng)的菌體，B為采用優(yōu)化后條件培養(yǎng)的菌體。由圖4可知，菌體外層半透明狀物質(zhì)即為菌體莢膜，在優(yōu)化后條件下培養(yǎng)的細(xì)菌，莢膜層增厚且有莢膜菌體數(shù)量增多。

表3 試驗(yàn)方案及結(jié)果

圖4 透射電鏡下的菌體Fig.4 Observed bacteria by TEMA：優(yōu)化前菌體；B：優(yōu)化后菌體Bacteria before optimization (A) and after optimization (B)

3 討 論

微生物發(fā)酵受內(nèi)部代謝機(jī)理、調(diào)控機(jī)制等影響，同時(shí)還受到外界環(huán)境(如培養(yǎng)基成分、發(fā)酵溫度及培養(yǎng)時(shí)間等)影響。因此篩選合適的培養(yǎng)基，并對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，對于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)等，顯得尤為重要[11-12]。本研究選取了4種培養(yǎng)基(THB、CB、NB和BHI)進(jìn)行金葡菌的發(fā)酵培養(yǎng)，對菌液吸光度、菌體濕重等指標(biāo)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，哥倫比亞培養(yǎng)基(CB)最適于金葡菌的生長，這一結(jié)果與國內(nèi)外多位學(xué)者研究結(jié)果一致。因此，本研究最終選擇CB作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

為進(jìn)一步提高金葡菌的產(chǎn)量，本研究通過單因素試驗(yàn)對不同外加營養(yǎng)成分(葡萄糖、乳糖、乳清和血清)、不同裝液量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速及乳清添加量等進(jìn)行了研究。與其他外加營養(yǎng)成分相比，添加乳清的培養(yǎng)基，更適合金葡菌的生長。乳清是干酪生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物，含有牛奶中一半以上的營養(yǎng)物質(zhì)，20%左右的牛奶蛋白、幾乎全部的乳糖、多種維生素以及礦物質(zhì)等[13]。試驗(yàn)用的金葡菌分離自患病奶牛乳汁中，因此乳清的添加更有利于該菌株的生長。乳清能否有利于其他來源金葡菌的生長，還有待于進(jìn)一步探究。試驗(yàn)表明，裝液量越少，越適于金葡菌的生長。這可能是由于裝液量越少，搖瓶中的空氣越充足，更適合細(xì)菌的生長繁殖。因此，搖瓶發(fā)酵金葡菌時(shí)，裝液量越少越好，但考慮到生產(chǎn)實(shí)際需求，本研究最終選擇30%的裝液量作為初始裝液量。由于發(fā)酵罐可以往發(fā)酵液內(nèi)不斷注入空氣，因此當(dāng)用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，裝液量的確定還需進(jìn)一步的研究。培養(yǎng)基的pH值對微生物的生長與代謝有較大影響，如微生物酶活性、細(xì)胞膜電荷及細(xì)胞膜通透性等，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的外排等。本研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌培養(yǎng)基初始pH 7.0為最佳，且在發(fā)酵過程中，菌液的pH值先下降，在發(fā)酵后期上升。大多數(shù)的葡萄球菌都能分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，產(chǎn)生乳酸、乙酸和蘋果酸等，這些有機(jī)酸的產(chǎn)生導(dǎo)致了pH值的下降。發(fā)酵后期菌體發(fā)生自溶，導(dǎo)致核酸類物質(zhì)外排，從而引起pH的上升；此外，其他生理酸堿性物質(zhì)利用后也會(huì)造成pH的波動(dòng)[14]。此外，接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速及乳清添加量對金葡菌的生長均有較大的影響，通過試驗(yàn)比較確定，調(diào)發(fā)酵液pH 7.0，添加2%乳清，30%裝液量，接種量1%，37 ℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)至16 h為最佳培養(yǎng)條件。

正交試驗(yàn)具有所需實(shí)驗(yàn)次數(shù)不多、可顯著提高試驗(yàn)效率,是科學(xué)研究中最常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法之一[15]。本研究利用SPSS軟件，以起始pH、接種量、發(fā)酵溫度及乳清添加量為試驗(yàn)因素，以菌體濕重為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì) L9(34)正交表，做正交試驗(yàn)。最終確定，調(diào)發(fā)酵液pH7.0，添加2%的乳清，30%的裝液量，1%的接種量，37 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)至16 h。與試驗(yàn)優(yōu)化前相比，菌體產(chǎn)量提高了20%。

本研究首次報(bào)道了乳清對金葡菌生長的影響，并利用透射電鏡對優(yōu)化前后的金葡菌進(jìn)行了比較觀察，結(jié)果表明，優(yōu)化后條件下培養(yǎng)的細(xì)菌，莢膜厚度增加，為后續(xù)莢膜多糖疫苗的研究提供了參考。然而，多糖的提取純化工藝尚未建立，因此未能對優(yōu)化前后細(xì)菌產(chǎn)生的多糖進(jìn)行提取，以比較莢膜多糖的增加量。