孫飛飛， 徐 曉， 陳璐佳， 董心怡， 王雅娟， 向海珍， 張桂山， 張應(yīng)烙*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華 321004； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081)

抗生素曾為人類健康做出了重要貢獻(xiàn)，但近年來由于抗生素的不合理使用及病原菌自身的遺傳進(jìn)化，耐藥性致病菌不斷產(chǎn)生[1]，人類很可能將陷入“無藥可用”的困境[2]，如何抵御耐藥性已成為全球性問題。針對目前可使用的抗菌物質(zhì)類型太少的問題，F(xiàn)ischbach等[3-4]認(rèn)為相應(yīng)的解決方法之一是從微生物等生物資源中發(fā)現(xiàn)具有新作用機(jī)制的新型抗菌化合物。當(dāng)前使用的抗生素主要來自土壤微生物[5]，然而，在一般土壤環(huán)境中很難再分離出能產(chǎn)出具有活性結(jié)構(gòu)新穎的化合物的微生物。因此，為了發(fā)現(xiàn)新穎抗生素，有必要在特殊環(huán)境中尋找新的微生物[6-7]。昆蟲是地球上數(shù)量最多、種類最豐富的生物體，它們與微生物間普遍存在互利共生關(guān)系，在長期共生的生存環(huán)境中存在的選擇壓力使它們相互間可能產(chǎn)生特殊的化學(xué)分子和生化代謝途徑[8]，研究表明一些昆蟲共生放線菌產(chǎn)生的新穎次生代謝物質(zhì)具有很好的選擇性抗菌活性，可能是新抗生素類物質(zhì)的重要來源[9]。如Oh等[10]從螞蟻共生放線菌中分離到新的抗菌活性物質(zhì)dentigerumycin。中華婪步甲(Harpalussinicus)一般生活在潮濕和悶濕的地方而且很少生病，推測這可能與其共生放線菌有關(guān)。本項目對中華婪步甲的共生放線菌進(jìn)行分離鑒定，測定其對多種人類致病菌的抗菌活性，旨在為開發(fā)新型微生物源殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 中華婪步甲(Harpalussinicus)采自浙江師范大學(xué)校園內(nèi)。

1.1.2 供試致病菌 白色念珠菌(Candidaalbicans)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。

1.2 方法

1.2.1 共生放線菌的分離及其發(fā)酵液的獲取 參考文獻(xiàn)[11]，將從浙江師范大學(xué)校園內(nèi)捕捉的中華婪布甲轉(zhuǎn)移至實驗室并饑餓處理24 h。無菌條件下，用75%酒精對中華婪布甲進(jìn)行表面消毒3 min，然后用無菌水清洗3 次，每次30 s，先用剪刀在昆蟲胸和腹部連接處橫向剪開，再用無菌刀片將腹部刨開，最后用無菌鑷子將腸道挑出并置于無菌研缽內(nèi)，加入少量無菌水進(jìn)行研磨。采用10倍稀釋法將其稀釋成10-1、10-2和10-3三個梯度。用移液槍取各個稀釋度稀釋液200 μL涂布于高氏一號培養(yǎng)基進(jìn)行分離。30 ℃下恒溫培養(yǎng)。待菌落長出后，純化得到單菌落菌株，將純菌落接種到斜面試管保存?zhèn)溆?。將純化的放線菌分別轉(zhuǎn)接到高氏一號液體培養(yǎng)基(裝液量100 mL/250 mL 三角瓶) 中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)7 d。所得發(fā)酵液經(jīng)6～8層紗布過濾，無菌條件下取10 mL過濾液用直徑為0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，將無菌濾液保存在已滅菌的10 mL離心管中備用。

1.2.2 BJ37發(fā)酵液不同極性物質(zhì)的提取 對BJ37液體發(fā)酵液濾液，依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，萃取液經(jīng)減壓濃縮得到不同極性溶劑粗提物。

1.2.3 共生放線菌菌株發(fā)酵液及提取物抑菌活性測定 參照文獻(xiàn)[12]，采用牛津杯法測定發(fā)酵液及提取物對三種致病細(xì)菌和白色念珠菌的抑制活性。將培養(yǎng)2 d的供試菌稀釋至濃度為3.0×108cfu/mL，白色念珠菌均勻涂布在麥芽浸汁固體培養(yǎng)基上，供試細(xì)菌均勻涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上。將滅菌的牛津杯放置于凝固后的培養(yǎng)基上，每杯加入100 μL待測發(fā)酵液或提取物。28 ℃培養(yǎng)1～2 d后觀察，十字交叉法測量抑菌圈的直徑。以無菌水作為陰性對照，重復(fù)3次。

1.2.4 BJ37的鑒定 ①BJ37形態(tài)特征觀察：采用插片法將菌株接種于高氏一號培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后觀察菌落的外部形態(tài)特征。利用光學(xué)顯微鏡，觀察基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲及孢子，對菌株進(jìn)行初步鑒定。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合鑒定手冊對菌株進(jìn)行初步鑒定。②分子生物學(xué)測定：利用細(xì)菌基因DNA試劑盒提取目標(biāo)菌株基因，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測序，對測序結(jié)果進(jìn)行對比分析，構(gòu)建發(fā)育樹。通過菌株的形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定確定菌株的種屬[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 35株中華婪步甲共生放線菌發(fā)酵液對4種致病菌生長的抑制作用

采用牛津杯法測試了35株中華婪步甲共生放線菌的發(fā)酵液對4種致病菌生長的抑制活性，結(jié)果見表1。結(jié)果表明除了BJ25無活性外，其他放線菌對至少一種供試菌具有抑制活性，其中BJ37對枯草芽胞桿菌和白色念珠菌抑菌效果突出，抑菌圈直徑分別可達(dá)49.2和30.0 mm。

表1 共生放線菌發(fā)酵液對致病菌的生長抑制作用

注：結(jié)果為抑菌圈直徑±3個平行測量值的標(biāo)準(zhǔn)(mm)；“-”為無抑菌活性；牛津杯的外徑為(7.8±0.1) mm；以無菌水作為對照處理

2.2 BJ37發(fā)酵液不同極性提取物對4種致病菌生長的抑制作用

BJ37發(fā)酵液不同極性提取物對3種致病細(xì)菌和白色念珠菌生長的抑制作用結(jié)果見表2，從表2數(shù)據(jù)可看出，BJ37發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物對枯草芽胞桿菌和白色念珠菌的抑菌效果明顯，抑菌圈直徑達(dá)到34.1 mm和29.3 mm，其他部位的抑菌效果較差。因此，BJ37發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性物質(zhì)主要集中在中等極性部分。

表2 BJ37發(fā)酵液不同極性提取物對致病菌的生長抑制作用Table 2 Inhibiting effect of BJ37 different polar extracts on pathogens

注：結(jié)果表示為抑菌圈直徑(mm)；a：石油醚相；b：乙酸乙酯相；c：正丁醇相；d：萃取后水相；粗浸膏質(zhì)量濃度為100 μg/mL；“-”表示沒有活性

2.3 BJ37菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征觀察 BJ37菌株在高氏一號培養(yǎng)基上，氣絲呈銀灰至黃白色，基絲呈淺黃色，菌落緊貼培養(yǎng)基生長，而且干燥、緊密，不易挑起(圖1)。鏡檢發(fā)現(xiàn)基內(nèi)菌絲分枝呈網(wǎng)狀；氣生菌絲生長茂密，呈分枝狀；孢子絲無螺旋，稍有彎曲；孢子近橢圓形。通過與伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊中所描述放射菌的特征比較，初步確定BJ37菌株相似菌株為鏈霉菌屬(Streptomyces)菌。

圖1 BJ37平板培養(yǎng)基正面形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of BJ37 colony

2.3.2 BJ37菌株16S rRNA序列分析 BJ37菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增后，通過測序得到其16S rRNA序列長度為1 439 bp， BLAST比對后并作系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)BJ37菌株與鏈霉菌屬委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)在系統(tǒng)發(fā)育樹上屬于同一支(圖2)，相似性高達(dá)99%。故BJ37菌株相似菌株為S.venezuelae。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株BJ37系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences of BJ37

3 討 論

昆蟲的數(shù)量基數(shù)大，共生微生物含量豐富，但目前僅對少數(shù)昆蟲中的部分放線菌進(jìn)行了 較為詳細(xì)的研究。昆蟲共生放線菌作為特境微生物中的一個類別，具有獨特的代謝過程和生理功能，為尋找具有新結(jié)構(gòu)特征或新作用特點的活性物質(zhì)提供了重要線索。目前已有多種活性較好的活性天然產(chǎn)物從昆蟲的共生放線菌中分離得到，它們在現(xiàn)代醫(yī)藥和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中具有一定的開發(fā)潛質(zhì)。本研究從中華婪布甲的腸道中分離到1株具有較好抗菌活性的共生放線菌BJ37，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察和16S rRNA序列分析確定菌株BJ37相似菌株為委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(S.venezuelae)。菌株BJ37其發(fā)酵液對枯草芽胞桿菌和白色念珠菌的抑菌圈直徑均大于30.0 mm，表現(xiàn)出良好的抗菌活性。進(jìn)一步對菌株BJ7的活性成分的分離鑒定、活性作用機(jī)理等研究，將有希望從中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的抗菌先導(dǎo)化合物。菌株BJ37具有開發(fā)成微生物源抗菌劑的潛力值得進(jìn)一步研究。