尹虹，李揚，羅穎，汝艷輝，鄒玉芬，潘銘智

(山東省婦幼保健院 國家衛(wèi)生計生委生育調(diào)控技術(shù)重點實驗室 山東省優(yōu)生技術(shù)重點實驗室，濟南250014)

胎兒染色體異常是嚴(yán)重的先天性疾病，開展產(chǎn)前診斷工作是降低新生兒染色體異常發(fā)生的重要措施。羊水細(xì)胞染色體核型檢測是目前進行胎兒染色體核型分析的金標(biāo)準(zhǔn)，是產(chǎn)前診斷最常用的侵入性操作[1]。但羊水穿刺屬于有創(chuàng)性操作，可導(dǎo)致0.2%～2.0%的孕婦發(fā)生流產(chǎn)、胎兒丟失[2]。產(chǎn)前超聲檢查是最常用的產(chǎn)前無創(chuàng)檢查方法，而無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(NIPT)是分析胎兒是否有染色體非整倍體異常的一項無創(chuàng)檢測技術(shù)，已在全球范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。本研究就早孕期超聲聯(lián)合NIPT篩查胎兒染色體異常的準(zhǔn)確性進行研究，探討非侵入性聯(lián)合篩查方法在早孕期診斷胎兒染色體異常的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 從2017年4月～2018年4月就診于我院進行早孕期篩查的3 617例孕婦中，篩選出需行羊水細(xì)胞染色體核型檢測的高危孕婦312例，年齡22～43歲，孕11～13+6周，單胎妊娠298例、多胎妊娠14例。納入標(biāo)準(zhǔn)：早孕期超聲結(jié)構(gòu)異常孕婦；NIPT篩查高風(fēng)險孕婦；高體質(zhì)量孕婦、高齡孕婦、體外受精-胚胎移植方式受孕孕婦、雙胎孕婦及合并惡性腫瘤孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：因中止妊娠而未行羊水細(xì)胞染色體核型檢測的孕婦；拒絕行羊水細(xì)胞染色體核型檢測的孕婦；錯過最佳羊水細(xì)胞染色體核型檢測時機的孕婦。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核同意，孕婦及家屬對診斷方法完全知曉，并自愿簽署知情同意書。

1.2 超聲檢查

1.2.1 超聲檢查方法 采用GE Voluson E10彩色多普勒超聲診斷儀，二維探頭，頻率1.6～4.5 MHz。孕婦檢查前排空膀胱，取仰臥位。對每一胎兒進行系統(tǒng)篩查，嚴(yán)格按照英國胎兒醫(yī)學(xué)基金會標(biāo)準(zhǔn)進行圖像采集及分析，由兩名獲得產(chǎn)前篩查資質(zhì)的醫(yī)生對圖像進行質(zhì)量控制。如因孕婦腹壁較厚等原因造成經(jīng)腹部圖像質(zhì)量欠佳，則行經(jīng)陰道超聲檢查，陰道探頭，頻率5～9 MHz。采集平面包括：①矢狀切面，顯示胎兒鼻骨、顱內(nèi)正中矢狀面、胸腹壁、脊柱的連續(xù)性及背部皮膚的完整性；②顱腦橫切面，顯示顱骨環(huán)狀強回聲、腦中線及雙側(cè)脈絡(luò)叢；③胸部橫切面，顯示心臟位置、心尖指向、四腔心結(jié)構(gòu)及注意是否有三尖瓣反流；④腹部橫切面，顯示胃泡、膀胱、臍帶腹壁入口、臍動脈及靜脈導(dǎo)管頻譜；⑤胎兒雙側(cè)上下肢切面，觀察雙側(cè)上下肢的完整性及活動狀態(tài)。

1.2.2 超聲判斷胎兒染色體異常標(biāo)準(zhǔn) 包括胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常、超聲軟指標(biāo)異常及其他與染色體異常相關(guān)的超聲指標(biāo)。結(jié)構(gòu)異常包括心臟畸形(明顯的心臟位置異常、單心室、完全性心內(nèi)膜墊缺損、典型的左心或右心發(fā)育不良)、十二指腸閉鎖、顱內(nèi)結(jié)構(gòu)異常(全前腦)、腹壁缺損(臍疝)、馬蹄內(nèi)翻足等外表肢體發(fā)育異常[3]。胎兒超聲軟指標(biāo)異常包括：腦室擴張、心室強光點、腸管強回聲、單臍動脈及腎盂擴張、股骨或肱骨短小、胎兒頸部透明帶的厚度(NT)增厚、鼻骨缺失、脈絡(luò)叢囊腫[4]。其他超聲指標(biāo)包括額上頜角增大、三尖瓣反流和靜脈導(dǎo)管a波倒置。

1.3 NIPT檢測 于早孕期采集孕婦外周血10 mL，置于EDTA抗凝管中，樣本收集后4 ℃條件下進行血漿分離，提取血漿中游離DNA，PCR擴增，獲得對應(yīng)樣本的DNA文庫，高通量檢測，將測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析。通過計算測試樣本待測染色體的比例與總體人群的比例之差，除以對照組中待測染色體的方差，所得值為Z值，其切值為±3。

1.4 羊水細(xì)胞染色體核型檢測 在超聲儀定位下，無菌操作行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，離心10 min，留取0.5 mL，制成細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)基混勻，置5%CO2、37 ℃溫箱行開放式培養(yǎng)。經(jīng)適當(dāng)天數(shù)更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察羊水細(xì)胞生長良好。向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入一定量的秋水仙素，使細(xì)胞分裂停止在中期，再經(jīng)37 ℃低滲、固定、制片、顯帶、染色處理，即得到用于染色體核型分析的羊水細(xì)胞表本片，再進行計數(shù)、核型分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。以羊水細(xì)胞染色體核型檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，使用χ2檢驗分析超聲、NIPT、超聲聯(lián)合NIPT三種篩查方案的準(zhǔn)確性。使用受試者工作特征(ROC)曲線，計算ROC曲線下面積(AUC)，分析超聲、NIPT及超聲聯(lián)合NIPT三種篩查方法的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 超聲篩查結(jié)果 共判定胎兒可能存在染色體異常78例。其中結(jié)構(gòu)異常26例，包括心臟結(jié)構(gòu)異常11例、巨膀胱1例、腹壁裂2例、臍膨出4例、全前腦3例、心臟結(jié)構(gòu)異常合并NT增厚2例、臍膨出合并NT增厚1例、先天性骨發(fā)育不良合并心臟結(jié)構(gòu)異常1例、單臍動脈合并腹壁裂及心臟結(jié)構(gòu)異常1例；胎兒超聲軟指標(biāo)異常44例，包括單臍動脈8例、鼻骨缺失6例、NT增厚21例、側(cè)腦室脈絡(luò)叢囊腫3例、股骨或肱骨短小3例、單臍動脈合并鼻骨缺失1例、NT增厚合并鼻骨缺失2例；其他超聲指標(biāo)異常8例，包括額上頜角增大3例、三尖瓣反流3例和靜脈導(dǎo)管a波倒置2例。

2.2 NIPT篩查結(jié)果 篩查出高風(fēng)險共計31例，其中21-三體綜合征(簡稱21-三體18)高風(fēng)險15例、18-三體綜合征(簡稱18-三體)高風(fēng)險12例、13-三體綜合征(簡稱13-三體)高風(fēng)險4例。

2.3 染色體核型分析結(jié)果 共檢測出染色體異常27例，其中21-三體15例、18-三體9例、13-三體2例、Turner綜合征1例。31例NIPT高風(fēng)險人群中，經(jīng)染色體核型分析確診為染色體異常者共26例，包括21-三體15例、18-三體9例、13-三體2例。

2.4 三種篩查方法的準(zhǔn)確性比較 超聲、NIPT、超聲聯(lián)合NIPT三種篩查方法的準(zhǔn)確性分別為34.6%(27/78)、87.1%(26/31)、93.1%(27/29)。超聲準(zhǔn)確性低于其他兩種方法(P均<0.01)，NIPT與超聲聯(lián)合NIPT檢測的準(zhǔn)確性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 超聲、NIPT及超聲聯(lián)合NIPT篩查方法的診斷效能比較 超聲聯(lián)合NIPT具有最高的AUC。見表1。

表1 三種方法診斷胎兒染色體異常的AUC

3 討論

盡早發(fā)現(xiàn)并診斷胎兒的嚴(yán)重結(jié)構(gòu)異常及染色體異常，不僅能夠減輕孕婦家庭及社會的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，而且也能夠在孕婦與胎兒尚未建立親密情感之前，最大程度減輕孕婦的身心傷害。對臨床醫(yī)師來說，能夠爭取一定時間，建立最佳臨床決策。目前，大多數(shù)地區(qū)進行產(chǎn)前篩查主要在妊娠中期采用血清學(xué)方法篩查胎兒染色體異常，及孕20～24周時采用超聲篩查胎兒結(jié)構(gòu)異常，如果篩查發(fā)現(xiàn)異常，則通過羊水穿刺或超聲進行診斷，以降低缺陷兒的出生率。但是因中孕期篩查和診斷異常胎兒一旦確診，終止妊娠的孕周較大，對母親身心影響也較大。Nicolaides等[5]提出，應(yīng)將產(chǎn)篩改變?yōu)榈菇鹱炙Ｊ?，不再將重點放在中晚孕，而是將篩查的核心放在早孕期，強調(diào)早孕期檢查不僅能診斷或提示大部分嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)異常，還能通過超聲軟指標(biāo)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)染色體非整倍體的胎兒。羊水穿刺、培養(yǎng)后進行傳統(tǒng)的染色體核型分析，為目前國內(nèi)外公認(rèn)的診斷染色體疾病的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。但中孕期進行羊水穿刺為一種創(chuàng)傷性診斷方法，介入性穿刺本身具有一定的風(fēng)險性，其并發(fā)癥主要包括流產(chǎn)、羊水自穿刺孔滲漏、胎兒損傷、宮內(nèi)感染、母體損傷等，其中0.2%～2.0%的羊水穿刺可能導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒丟失[2]。另一方面，羊水穿刺能夠增加孕婦及家屬的焦慮和精神負(fù)擔(dān)，孕婦對羊水穿刺的接受程度不高。因此，尋求另一種無創(chuàng)傷、孕婦接受程度高的方法評價胎兒是否有染色體異常具有重要意義。

產(chǎn)前超聲檢查對于降低出生缺陷、提高人口整體質(zhì)量具有重要作用。隨著超聲儀器分辨率及超聲診斷醫(yī)師水平的不斷提高，使得在早孕期對胎兒進行全面評估并診斷較嚴(yán)重畸形成為可能。早孕期超聲篩查主要包括兩部分內(nèi)容，篩查非整倍體染色體異常和篩查嚴(yán)重結(jié)構(gòu)異常。國際婦產(chǎn)科超聲學(xué)會(ISUOG)2013年提出，超聲技術(shù)的發(fā)展尤其高頻率經(jīng)陰道探頭的使用可在早孕期詳細(xì)評價胎兒發(fā)育情況；其發(fā)布的孕11～13+6周早期胎兒超聲檢查操作指南中指出，早孕期超聲檢查可確定胎兒存活情況并測量胎兒大小以核對孕周，測量NT值協(xié)助染色體篩查，多胎妊娠時可明確胎兒數(shù)目以及絨毛膜性，并且提出早孕期還應(yīng)對胎兒解剖結(jié)構(gòu)進行詳細(xì)探查，包括頭、頸部、顏面、脊柱、胸部、心臟、腹部、腹壁、四肢以及胎盤、臍帶等胎兒附屬物[7]。對胎兒進行細(xì)致的早孕期篩查，不僅可檢查出絕大多數(shù)的畸形，而且能夠指導(dǎo)孕婦對染色體是否存在異常進行進一步篩查。早孕期胎兒超聲篩查染色體異常的指標(biāo)主要有NT增厚、鼻骨缺如、三尖瓣反流、靜脈導(dǎo)管a波反向、額上頜角增大等。利用NT增厚篩查21-三體的靈敏度為80%，假陽性率為5%[8]。鼻骨缺如篩查21-三體的陽性似然比為146(95%CI50～434)[9]。單純利用靜脈導(dǎo)管a波異常篩查非整倍體染色體異常效能較低，但聯(lián)合利用NT和靜脈導(dǎo)管a波異常其篩查非整倍體染色體異常的靈敏度可達93.5%[10]。本研究中，超聲篩查出的嚴(yán)重結(jié)構(gòu)異常主要包括心臟結(jié)構(gòu)異常(心內(nèi)膜墊缺損、單心室、右室雙出口，肺動脈瓣缺如等)、無腦畸形、先天性骨發(fā)育不良、巨膀胱、腹腔囊腫、消化道畸形、臍膨出、腹壁裂、全前腦等，同時也包括單臍動脈、側(cè)腦室脈絡(luò)叢囊腫、鼻骨缺失、NT增厚等能提示染色體異常的超聲軟指標(biāo)，及與染色體有關(guān)的異常指標(biāo)包括三尖瓣反流、靜脈導(dǎo)管a波倒置和額上頜角增大等。這些均提示早孕期超聲篩查不僅對診斷嚴(yán)重結(jié)構(gòu)異常具有重要臨床價值，對可疑染色體異常的胎兒也能及時發(fā)現(xiàn)，并能及時建議孕婦做進一步檢查以確診。

NIPT技術(shù)是通過抽取母體外周血檢測胎兒游離DNA含量，推算染色體異常風(fēng)險率。Fan等[11]首次基于高通量測序?qū)?8例樣本進行分析，準(zhǔn)確檢出9例21-三體、2例18三體、1例13三體和6例染色體整倍體。隨后的研究表明，無創(chuàng)基因檢測技術(shù)對染色體非整倍體檢測的特異性和敏感度分別達99%和100%，假陽性率低于5%[12,13]。本研究中，NIPT高風(fēng)險31例，對21-三體的診斷準(zhǔn)確率較高，而對于18-三體及13-三體的診斷準(zhǔn)確率較低，可能與18-三體及13-三體的樣本較少有關(guān)。

胎兒染色體異常是嚴(yán)重的先天性疾病，開展產(chǎn)前診斷工作是降低染色體異常的發(fā)生的重要措施。產(chǎn)前常見的遺傳疾病有21-三體、18-三體、13-三體、Turner綜合征、Klinefelter綜合征等，羊水穿刺胎兒染色體核型分析對準(zhǔn)確判斷胎兒染色體有著重要作用。有研究表明，在高危孕婦中羊水細(xì)胞染色體異常檢出率為2.80%～5.80%[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，早孕期超聲篩查胎兒染色體異常的診斷效能低于NIPT，而超聲篩查聯(lián)合NIPT能夠提高診斷胎兒染色體異常的診斷效能，提示超聲篩查聯(lián)合NIPT能更好、更早地篩查染色體非整倍體異常。超聲結(jié)構(gòu)異常雖然能夠提示染色體異常，但有些染色體異常的胎兒在超聲篩查中表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上未見明顯重大異常。因此，早孕期超聲篩查雖然能排查出胎兒嚴(yán)重結(jié)構(gòu)問題，但對于染色體異常的篩查還需要NIPT的輔助。本研究中有1例在早孕期NIPT篩查為低風(fēng)險，早孕超聲提示NT增厚，行中孕期羊水細(xì)胞染色體核型分析，檢查結(jié)果為Turner綜合征。此病例提示盡管NIPT篩查為低風(fēng)險，但是如果胎兒合并與染色體異常有關(guān)的超聲表現(xiàn)時，也要建議孕婦進一步做羊水細(xì)胞染色體核型分析以確診胎兒是否有染色體異常。

我們認(rèn)為：①早孕期超聲篩查雖然能夠檢查出胎兒嚴(yán)重結(jié)構(gòu)異常，但是其也有自身局限性，對于染色體異常的胎兒，其檢出率并不高，特別是21-三體的胎兒，由于缺乏特異性超聲表現(xiàn)，超聲未必有可見的結(jié)構(gòu)異常。②NIPT對染色體異常篩查雖然具有一定優(yōu)勢，能夠避免產(chǎn)前診斷引起的流產(chǎn)和宮內(nèi)感染，但也有其自身局限性，能夠影響孕婦外周血游離胎兒DNA的因素都能夠影響到結(jié)果。③NIPT雖然能夠篩查一部分染色體異常，但是對于早孕期超聲篩查有異常，特別是有超聲軟指標(biāo)異常者，應(yīng)行中孕期羊水細(xì)胞染色體核型分析。④對于高體質(zhì)量孕婦、高齡孕婦、體外受精-胚胎移植方式受孕孕婦、雙胎孕婦及合并惡性腫瘤孕婦，即使早孕超聲與NIPT篩查未見異常，也建議于中孕期行羊水細(xì)胞染色體核型分析。

綜上所述，早孕期超聲檢查聯(lián)合NIPT檢測能夠提高染色體異常的檢出率，能夠及時篩查出嚴(yán)重危害胎兒的結(jié)構(gòu)畸形及染色體異常，為臨床決策爭取一定時間，同時超聲檢查聯(lián)合NIPT檢測為非侵入性的篩查，可盡可能地減輕對孕婦及胎兒的身心傷害。