劉廣芹，涂玉蓉，江耀倫，李美娣，易永萍，陳素珍，溫 馨，武 力

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/廣州華農(nóng)大實(shí)驗(yàn)獸藥有限公司，廣東廣州 510642)

功能性低聚糖作為無殘留、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無毒無害無副作用的綠色添加劑，對動(dòng)物機(jī)體腸道菌群調(diào)節(jié)作用效果顯著。研究發(fā)現(xiàn)功能性低聚糖能夠促進(jìn)腸道有益菌的增殖，抑制有害菌的生長[1-3]。目前已研究發(fā)現(xiàn)的功能性低聚糖有20多種，主要有低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖等[4]。低聚半乳糖是已被開發(fā)的唯一源自動(dòng)物乳汁的低聚糖[5],其安全度高，食療效果明顯，對人體健康有益，已獲得廣泛認(rèn)可。本研究主要分析低聚半乳糖在體內(nèi)外對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，為低聚半乳糖在臨床上的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大腸埃希菌O78(CVCC1569)、嗜酸乳桿菌，廣州華農(nóng)大實(shí)驗(yàn)獸藥有限公司研發(fā)中心保存菌種。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c雄性小鼠50 只，6周齡～8 周齡，體重18 g～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號SCXK(粵)2013—0002。

1.1.3 試劑 70%低聚半乳糖粉，云浮市新金山生物科技有限公司產(chǎn)品；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基TSC培養(yǎng)基、D-環(huán)絲氨酸、革蘭染色液，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 體外試驗(yàn) 用20、30、40 g/L的低聚半乳糖處理培養(yǎng)基，含葡萄糖培養(yǎng)基為對照組。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[6]對大腸埃希菌和乳酸桿菌進(jìn)行稀釋和培養(yǎng)，觀察不同添加量低聚半乳糖對大腸埃希菌和乳酸桿菌生長的影響。

分別取含有20、30、40 g/L的低聚半乳糖的LB肉湯培養(yǎng)基200 μL于96孔板內(nèi)，然后接種稀釋10-7倍大腸埃希菌菌液100 μL，每組3個(gè)平行，置36℃±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，每隔3 h測定630 nm的吸光度，連續(xù)測定24 h并繪制生長曲線。相同方法，將乳酸桿菌稀釋10-8倍，厭氧培養(yǎng)測定乳酸桿菌630 nm的吸光度。

1.2.2 體內(nèi)試驗(yàn) 參考《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范2003》[7]中調(diào)節(jié)腸道菌群功能檢測方法，試驗(yàn)分別設(shè)人體推薦劑量的5、10、30倍作為試驗(yàn)劑量，設(shè)立對照組。具體處理見表1。

稱取各組小鼠體重取平均值，并分別將含量為70%的低聚半乳糖根據(jù)上表中的劑量進(jìn)行相應(yīng)受試物的配制，受試藥物用無菌蒸餾水配制，滅菌，分裝，不同劑量組試樣4℃冷藏保存。在第0、7、14天無菌壓迫法定量采集小鼠新鮮糞便，處理后進(jìn)行菌群培養(yǎng)和鑒定，對大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)菌落在30～300之間的平板，計(jì)算出每克糞便中的活菌數(shù)(CFU/g)，換算成以10為底的對數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件中單因素方差分析(One-Way ANVOA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著，均值采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

表1 低聚半乳糖體外試驗(yàn)分組及處理

注：每組每日清晨一次經(jīng)口灌胃0.2 mL ，連續(xù)灌胃14 d。對照組灌胃無菌蒸餾水。

Note: Each group was orally administered 0.2 mL once daily in the morning and continued for 14 days.The control group was given sterile distilled water.

2 結(jié)果

2.1 低聚半乳糖對大腸埃希菌和乳酸桿菌的影響

按照20、30、40 g/L劑量添加低聚半乳糖，大腸埃希菌菌落數(shù)分別為3.70×108、1.96×108、2.4×108CFU/mL，乳酸桿菌菌落數(shù)分別為4.73×109、4.20×109、3.80×109CFU/mL。其中30 g/L組和40 g/L組大腸埃希菌菌落數(shù)與對照組3.2×108CFU/mL相比差異顯著 (P<0.05)，乳酸菌各組與對照組3.27×109CFU/mL相比落數(shù)均有不同程度的增長(P<0.05)，由此可以看出，體外添加一定濃度的低聚半乳糖對大腸埃希菌增殖具有一定的抑制作用，當(dāng)添加量為30 g/L時(shí)效果最明顯；體外添加一定濃度低聚半乳糖對均能促進(jìn)乳酸菌生長(圖1和圖2)。

2.2 低聚半乳糖對大腸埃希菌和乳酸桿菌OD值的影響

由圖3可知，大腸埃希菌可以利用低聚半乳糖，轉(zhuǎn)接后的6 h內(nèi)大腸埃希菌的生長比較緩慢，在6 h～9 h內(nèi)大腸埃希菌生長速度，在16 h開始菌體濃度趨于穩(wěn)定，此時(shí)30 g/L濃度的低聚半乳糖組大腸埃希菌的濃度最低。由圖4可知，乳酸桿菌可以利用低聚半乳糖，轉(zhuǎn)接后的15 h內(nèi)乳酸菌的生長比較緩慢，在15 h～30 h內(nèi)乳酸菌生長速度，在36 h開始菌體濃度趨于穩(wěn)定，此時(shí)30 g/L半乳糖組乳酸桿菌濃度最高。

圖1 低聚半乳糖對大腸埃希菌體外增殖效果

圖2 低聚半乳糖對乳酸桿菌體外增殖效果

2.3 低聚半乳糖對小鼠糞便中大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸桿菌的作用

用低聚半乳糖對小鼠進(jìn)行14 d灌胃飼養(yǎng)，結(jié)果顯示，灌胃第7天與灌胃前比較，低、中、高劑量組大腸埃希菌數(shù)量均明顯減少(P<0.05)，灌胃第7天低聚半乳糖低、中、高劑量組大腸埃希菌數(shù)量分別為5.22、5.25、5.52 log CFU/g,表明低聚半乳糖可抑制小鼠體內(nèi)大腸埃希菌的增殖，本試驗(yàn)中灌胃第7天低聚半乳糖各劑量組對大腸埃希菌增殖有不同程度抑制作用，其中低聚半乳糖中低劑量組對大腸埃希菌的抑制效果最明顯(圖5)。

用低聚半乳糖灌胃小鼠第7天和第14天，低、中、高劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量比對照組明顯減少(P<0.05)。灌胃第7天低聚半乳糖低、中、高劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量分別為4.85、5.13、5.08 logCFU/g；灌胃第14天低聚半乳糖低、中、高劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量分別為4.80、5.05、5.09 logCFU/g；從灌胃7天和14天的數(shù)據(jù)得出灌胃7 d～14 d內(nèi),小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量保持相對穩(wěn)定(圖6)。

灌胃第7天時(shí)低聚半乳糖低劑量組和高劑量組乳酸桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，灌胃第14天低、中劑量組乳酸桿菌數(shù)量增加，但低劑量組灌胃14天乳酸菌數(shù)量比灌胃第7天減少，高劑量組灌胃14 d與灌胃第0、7天比較乳酸桿菌減少，均具有顯著差異(P<0.05)。灌胃第7天低聚半乳糖低、中、高劑量組乳酸桿菌數(shù)量分別為8.82、8.34、8.62 logCFU/g；由此可知，低聚半乳糖在一定的濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)乳酸桿菌的增殖(圖7)。

圖3 大腸埃希菌的生長曲線

圖4 乳酸菌的生長曲線

圖5 低聚半乳糖對小鼠腸道大腸埃希菌的影響

圖6 低聚半乳糖對小鼠腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的影響

圖7 低聚半乳糖對小鼠腸道乳酸桿菌的影響

3 討論

動(dòng)物機(jī)體健康的腸道菌群環(huán)境參與動(dòng)物的生長、發(fā)育、代謝、營養(yǎng)吸收、免疫等過程，為機(jī)體健康構(gòu)建一道防御屏障[8]。腸道疾病的發(fā)生受飼料、水源、環(huán)境衛(wèi)生、溫度、濕度、動(dòng)物自身免疫力等多種因素影響。腸道中繁雜的微生物在機(jī)體健康狀態(tài)下互相依存、互相制約構(gòu)建菌群平衡，其中最主要的有益菌乳酸桿菌對腸道健康起到重要調(diào)節(jié)作用。De Angelis M等[9]發(fā)現(xiàn)，仔豬飼喂乳酸菌腸道內(nèi)大腸埃希菌數(shù)量下降，腹瀉得到改善，因此提高動(dòng)物腸道有益菌數(shù)量，減少有害菌是保證腸道健康的重要途徑。Roberfroid M等[10]研究發(fā)現(xiàn)，低聚糖能夠增加乳酸菌的數(shù)量，減少有害菌，該研究結(jié)果與本研究低聚半乳糖對小鼠腸道菌調(diào)節(jié)作用結(jié)果相一致。

本研究中在體外試驗(yàn)下低聚半乳糖在30 g/L濃度下顯著抑制了大腸埃希菌的生長，促進(jìn)了乳酸桿菌的生長。在小鼠腸道體內(nèi)試驗(yàn)中，低聚半乳糖在灌胃第7天明顯抑制了大腸埃希菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖，有效促進(jìn)了乳酸桿菌的增殖，與本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及Blaut M等[11]、Alliet P等[12]對功能性低聚糖能夠抑制有害菌促進(jìn)有益菌生長的研究結(jié)果一致。

本研究低聚半乳糖在體外可以抑制大腸埃希菌的生長，促進(jìn)乳酸桿菌生長，結(jié)合低聚半乳糖體外對大腸埃希菌的抑制和對乳酸桿菌的促進(jìn)作用，以及臨床應(yīng)用的成本得出最佳濃度為30 g/L。

體內(nèi)試驗(yàn)中低聚半乳糖在小鼠腸道內(nèi)促進(jìn)乳酸桿菌的增殖，抑制大腸埃希菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖。體內(nèi)試驗(yàn)中低聚半乳糖和低聚果糖對大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸桿菌的作用受低聚糖的劑量和灌胃時(shí)間影響，本研究中灌胃第7天低劑量組低聚半乳糖對腸道菌群調(diào)節(jié)作用最佳，灌胃14 d時(shí)大腸埃希菌和乳酸桿菌增減不一。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范2003》中腸道菌群測定中的判定標(biāo)準(zhǔn)，灌胃7 d小鼠糞便中乳桿菌的數(shù)量增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量減少且大腸埃希菌的數(shù)量減少，表明低聚半乳糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群作用。