彭成彬，柯棟賢，陳美霞，劉偉,*，曹榕彬，蔡遠(yuǎn)

1.福建農(nóng)林大學(xué)，350002；2.寧德師范學(xué)院，352100；3.寧德市農(nóng)業(yè)局土壤肥料技術(shù)站，352100；4.寧德市蕉城區(qū)茶業(yè)管理局技術(shù)推廣站，352100

鐮刀菌（Fusarium spp.）是一種重要的真菌類群，屬于腐生型或兼性寄生真菌。不僅在動(dòng)植物有機(jī)體以及土壤中存在，甚至在干旱、炎熱的沙漠和嚴(yán)寒的北極均有發(fā)現(xiàn)。研究表明鐮刀菌不僅可侵染多種糧食作物（水稻、玉米、小麥）、藥用植物（三七、黃芪、白術(shù)）、經(jīng)濟(jì)作物（茶樹(shù)、甘蔗、麻類）導(dǎo)致寄主大量減產(chǎn)，嚴(yán)重的甚至?xí)斐芍参锟菸?，根、莖、花以及穗腐爛[1-2]。鐮刀菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物鐮刀菌毒素，該毒素不僅會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生嚴(yán)重污染，還會(huì)對(duì)人體以及動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重的安全隱患[3-4]。目前，鐮刀菌的防治方法最常用的是使用殺菌劑以及作物的輪作栽培、對(duì)土壤栽培基質(zhì)進(jìn)行消毒和發(fā)現(xiàn)病株及時(shí)拔除和銷(xiāo)毀。但是土地資源的有限導(dǎo)致輪作方法不易實(shí)施，對(duì)土壤進(jìn)行消毒和拔除病株不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且使用殺菌劑防治也會(huì)對(duì)土壤及人體產(chǎn)生危害。

隨著大量鐮刀菌的發(fā)現(xiàn)，種類越來(lái)越多，種與亞種之間的差異越來(lái)越小，僅僅依靠形態(tài)學(xué)鑒定菌株是不準(zhǔn)確的，還需要更深一步了解植物病原菌的種類及其特征。而系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記就是利用不同個(gè)體間的基因片段對(duì)遺傳關(guān)系進(jìn)行闡述，通過(guò)單個(gè)基因序列分析或者結(jié)合多個(gè)基因序列可以對(duì)不同種菌株之間的親緣關(guān)系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[5]；通過(guò)分析菌株基因型和表現(xiàn)型，可以揭示菌株DNA遺傳本質(zhì)，適合于所有菌株，并且只需要少量DNA即可完成。此外可以充分利用NCBI上已投遞的數(shù)據(jù)，對(duì)不同國(guó)家不同研究團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果進(jìn)行比較分析。因此利用核酸序列分析系統(tǒng)研究真菌分類近些年在全球得到廣泛快速應(yīng)用。

核糖體DNA是一段重復(fù)的序列，每個(gè)重復(fù)單元的組成由非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和3種RNA（18sRNA、28sRNA、5.8sRNA）基因編碼組成。因其具有良好的同質(zhì)性，在細(xì)胞中以一種協(xié)同方式進(jìn)化，少量的DNA變異情況的個(gè)體抽樣就能有效地代表種群來(lái)源?；谝陨咸攸c(diǎn)開(kāi)發(fā)了ITS （Internal transcribed spacer）[6]與LSU （Ribosomal RNA large subunit gene）[7]兩種標(biāo)記，作為真菌通用DNA條形碼。微管在細(xì)胞分裂、細(xì)胞形態(tài)和物質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用，其中β-微管蛋白由β-tubulin基因所編碼，該基因與生物進(jìn)化密切相關(guān)[8]。目前已有諸多利用這3種標(biāo)記進(jìn)行菌類鑒定的報(bào)道，鑒定快速，結(jié)果準(zhǔn)確[9-15]。

金萱品種適合制作烏龍茶，近年來(lái)隨著大面積的栽培，病蟲(chóng)害也有逐年遞增的趨勢(shì)。本試驗(yàn)以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類為基礎(chǔ)，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，擴(kuò)增目的菌株的ITS、β-Tub、LSU的部分基因序列，鑒定目的菌株為三線鐮刀菌，研究結(jié)果可為今后茶葉病害防治提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料

試驗(yàn)材料為福建省周寧縣金萱品種茶樹(shù)發(fā)病葉片。

2.鐮刀菌的分離與純化

采用組織分離法，將發(fā)病葉片先用流動(dòng)自來(lái)水沖洗30 min，再用75%酒精浸泡30 s，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液浸泡1 min，取出后用ddH2O沖洗3次，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿晾干。用無(wú)菌刀片在病健交界處剪成小塊（約2 mm2）接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，置于恒溫培養(yǎng)箱中26℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，反復(fù)純化4～5次，得到該病原菌的純培養(yǎng)物。以下實(shí)驗(yàn)將純化后的病原菌菌株命名為ZJX。

3.致病性測(cè)定

根據(jù)科赫法則，將純化好的菌株26℃培養(yǎng)7 d，將健康茶樹(shù)葉片表面消毒，用5 mm打孔器取菌絲塊接入人為劃傷表面，接種3 d后葉片發(fā)病。培養(yǎng)皿觀察發(fā)現(xiàn)以刺傷點(diǎn)為中心的小圓點(diǎn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，形成褐色或黑褐色病斑，采取常規(guī)組織分離法進(jìn)行再次分離。

4.菌落形態(tài)觀察與生長(zhǎng)速度

將純化后的菌絲接種至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，26℃恒溫培養(yǎng)。從第二天開(kāi)始，使用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，計(jì)算生長(zhǎng)菌落直徑，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件處理。隨后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察（菌落在PDA上的質(zhì)地、顏色以及基質(zhì)顏色）和顯微形態(tài)觀察（分生孢子、形態(tài)產(chǎn)孢細(xì)胞）。

5.菌株P(guān)CR鑒定

（1）PCR產(chǎn)物的回收

采用植物基因組提取試劑盒（TIANGEN公司）提取菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2xTaq PCR Master Mix溶液10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，根據(jù)不同引物設(shè)置相應(yīng)的退火溫度退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃總延伸7 min，16℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，150 V電泳30 min。使用快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（BioTeke公司）回收目的基因。本研究所用序列委托上海生工合成，引物序列參照文獻(xiàn)（表1）[9-15]。

（2）克隆，測(cè)序及分析

將目的基因與pMD18-T載體連接，采用熱激法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落驗(yàn)證陽(yáng)性克隆后將菌液送至博尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序所得序列在GenBank進(jìn)行BLAST搜索，利用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列分析。

表1 引物序列

二、結(jié)果與分析

1.菌株的形態(tài)特征

對(duì)病葉進(jìn)行分離，開(kāi)始每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放3～5個(gè)病葉，26℃恒溫培養(yǎng)（圖1），然后挑取菌落邊緣菌絲至新的PDA平板，反復(fù)純化4～5次，得到該病原菌的純培養(yǎng)物。

圖1 病原菌分離

2.菌株致病性回接

根據(jù)科赫法則，將純化好的菌株的菌絲塊接入新鮮且大小一致的健康茶樹(shù)葉片，3 d后葉片發(fā)病。培養(yǎng)皿觀察發(fā)現(xiàn)以刺傷點(diǎn)為中心的小圓點(diǎn)，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，形成褐色或黑褐色病斑，采取常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離，純化后的菌株和接種用的供試菌株，培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征一致。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲與之前結(jié)果一致，證明再次分離的病原菌為接種的菌株ZJX（圖2）。

圖2 病原菌分離

3.菌株的形態(tài)特征

菌株ZJX在PDA培養(yǎng)基上（26℃）生長(zhǎng)迅速（圖3），菌絲繁茂致密，幼齡菌絲呈現(xiàn)白色，邊緣不規(guī)則，基內(nèi)呈酒紅色。通過(guò)鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，大型分生孢子大部分長(zhǎng)度上直徑相等，呈現(xiàn)鐮刀狀，兩端漸尖彎曲，有3～5個(gè)隔閡，多數(shù)為3個(gè)隔閡，小型分生孢子為長(zhǎng)橢圓形（圖4）。根據(jù)上述形態(tài)特征，參照魏景超[16]的《真菌鑒定手冊(cè)》和布斯[17]的《鐮刀菌屬》手冊(cè)，初步判定ZJX菌株為鐮刀菌屬（Fusarium spp.）枝孢組（Sporotrichiella）的三線鐮刀菌（F.tricinctum）。

圖3 菌株ZJX生長(zhǎng)速率

圖4 菌株ZJX形態(tài)特征

4.基因序列分析

采用 ITS1和ITS4、NL1和 NL4、BT2a和BT2b 3對(duì)引物，對(duì)菌株ZJX的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆后測(cè)序，得到大小為565 bp的ITS基因序列、343 bp的β-Tub基因序列和608 bp的LSU基因序列。菌株的基因泳帶及大小如圖5。

圖5 擴(kuò)增菌株ZJX后的PCR電泳圖

測(cè)序序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì)，下載數(shù)據(jù)庫(kù)中屬、種的相似度較高的菌株序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從圖6至圖8中可以看出菌株ZJX的ITS、β-Tub和LSU序列在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上歸到鐮刀菌屬，不同種均位于不同分支末端，親緣關(guān)系較近的菌株都不同程度地聚在一起，鑒定能力較好。

圖6 基于ITS序列分析構(gòu)建NJ-系統(tǒng)樹(shù)

從圖6可知，ITS與NCBI上投遞的三線鐮刀菌菌株（Fusarium tricinctum）聚在一個(gè)較大分支上，并且支持率達(dá)98%，說(shuō)明其兩兩之間親緣關(guān)系較近。由圖7可知，不同種的鐮刀菌在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上分為兩大類，同種的聚為一支。菌株ZJX的β-Tub與投遞的菌株三線鐮刀菌（F.tricinctum）親緣關(guān)系最近，位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同一支，聚為一類。遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)（圖9），菌株的ZJX的β-Tub與F.tricinctum遺傳距離較遠(yuǎn)，造成該原因可能是該三線鐮刀菌是寄主于高海拔的草根上，久而久之造成基因組發(fā)生改變，從而導(dǎo)致在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分類上被區(qū)分開(kāi)來(lái)。

由圖8可以看出，基于LSU序列分析構(gòu)建NJ-系統(tǒng)樹(shù)，不同種菌株都分在不同分支末端，雖然目前基因庫(kù)上尚未有應(yīng)用LSU序列分析對(duì)三線鐮刀菌的鑒定，但結(jié)果顯示，利用LSU序列能區(qū)分不同種，說(shuō)明LSU能夠很好地鑒別種間的差異性。

三、結(jié)論

圖7 基于β-Tub序列分析構(gòu)建NJ-系統(tǒng)樹(shù)

圖8 基于LSU序列分析構(gòu)建NJ-系統(tǒng)樹(shù)

圖9 部分菌株β-Tub序列遺傳距離

本研究從福建省周寧縣金萱茶樹(shù)葉部斑點(diǎn)中分離到1種真菌，通過(guò)分析菌株在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度、菌落顏色、分生孢子的大小和形狀，可對(duì)菌種進(jìn)行初步鑒定。結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)技術(shù)ITS、LSU和β-Tub序列分析，通過(guò)序列比對(duì)分析，結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果一致，肯定了形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性，同時(shí)也確認(rèn)了ITS、LSU和β-Tub序列用于鐮刀菌分類鑒定的可靠性。

通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定真菌向來(lái)是研究者的工作難題，因?yàn)榉N與種之間的相似性在形態(tài)學(xué)上差別很小，而且鑒定特征有時(shí)不容易形成，不仔細(xì)辨別觀察，很容易對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成錯(cuò)誤的鑒定?；蛐蛄蟹治雠cDNA指紋技術(shù)等已作為鑒定真菌種與種之間親緣關(guān)系研究的一項(xiàng)重要輔助手段，廣泛應(yīng)用于種類鑒定和多樣性研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒別相比，分子系統(tǒng)學(xué)更能直接客觀地反映鐮刀菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。