尹樂樂, 葉莎莎， 歐陽東云， 曾耀英

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院臨床檢驗中心，2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院組織移植與免疫研究中心， 廣東 廣州 510632)

紅景天苷(salidroside，Sal)是從傳統(tǒng)藏藥紅景天(Rhodiolarosea)根部提取出來的一種具有苯酚結(jié)構(gòu)的化合物[1]。Sal作為傳統(tǒng)藏藥廣泛應(yīng)用于抗炎[2]、抗氧化[3]和抗疲勞等方面的治療。有研究表明，Sal對多種細胞(如神經(jīng)細胞、心肌細胞及內(nèi)皮祖細胞[4]等)具有抗凋亡作用。在Sal對機體固有免疫細胞的影響方面，我們已在前期實驗中證實了Sal對小鼠腹腔巨噬細胞體外增殖、吞噬及NO產(chǎn)生均有促進作用，而對細胞凋亡和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生均有抑制作用[5]。在Sal與T淋巴細胞研究方面，目前已有文獻表明，紅景天苷對某些動物模型體內(nèi)T淋巴細胞型別轉(zhuǎn)換及相關(guān)細胞因子調(diào)節(jié)具有一定的作用[4-7]，但其對小鼠原代T淋巴細胞體外行為的影響卻鮮有報道。因此，我們通過分析Sal對小鼠T淋巴細胞體外活化、增殖、ROS產(chǎn)生及凋亡的影響，評價其免疫效應(yīng)及作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級 BALB/c近交系雄性小鼠，3～4周齡及8～10 周齡，均購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號為SYXK(粵)2012-0122。 其中，3～4周齡清潔級 BALB/c近交系小鼠用于獲取胸腺T淋巴細胞，8～10周齡清潔級 BALB/c近交系小鼠用于獲取淋巴結(jié)T淋巴細胞。

2 主要試劑和儀器

紅景天苷購自中國江蘇華榮生物科技有限公司，粉末狀，水溶性，純度為99 %，將紅景天苷用PBS溶解配制成 400 mmol/L的儲存液，分裝，于-20 ℃避光保存，臨用前用 PBS稀釋成工作液；RPMI-1640 細胞培養(yǎng)液和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；大鼠抗小鼠CD3-PE和倉鼠抗小鼠CD69-FITC購自BD Pharmingen；羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE)購自Molecular Probe；L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)、刀豆蛋白 A(concanavalin A，Con A)、地塞米松(dexamethasone，DEX)、DMSO、MTT、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,H2DCFDA)及DiOC6(3)均購自Sigma。

手術(shù)剪、眼科剪和眼科鑷購自中國蘇州手術(shù)器械廠；細胞培養(yǎng)板、移液管、離心管、平皿和培養(yǎng)瓶均購自Corning;流式細胞儀(FACSCalibur)購自Becton Dickinson；酶標(biāo)儀(680 型)購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1淋巴細胞懸液的制備 將BALB/c小鼠斷髓處死，浸泡于75%乙醇中進行消毒，無菌分離雙側(cè)腋窩、鎖骨下、腹股溝淺淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)，置于盛有預(yù)冷的PBS的無菌平皿中，去掉被膜，研磨，200目尼龍網(wǎng)過濾。收集細胞，PBS離心(250×g, 4 ℃， 5 min)洗滌細胞2次，用RPMI-1640 完全培養(yǎng)液(含10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、50 μmol/L β-ME、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素)調(diào)成密度為3×109/L的淋巴細胞懸液。

3.2MTT比色法檢測Sal對小鼠T淋巴細胞活力的影響 實驗分組：陰性對照(negative)組、正常對照(control)組和單純藥物(Sal)組，每組設(shè)3個復(fù)孔。將密度為3×109/L的細胞懸液接種在96孔板中，每孔190 μL，加入10 μL終濃度分別為80 μmol/L、160 μmol/L和320 μmol/L的Sal工作液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTT (5 mg/L)，避光孵育4 h后，離心(300×g，5 min)棄上清,每孔加100 μL DMSO，振蕩器上避光振蕩10 min，以溶解孔底紫色結(jié)晶，在酶標(biāo)儀490 nm波長檢測各孔吸光度(A)值，并計算細胞的相對存活率，細胞相對存活率(%)=(Sal組A值-negative 組A值)/(control組A值-negative 組A值)×100%。

3.3熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色分析T淋巴細胞活化抗原CD69表達水平 實驗分組：control組、Con A組和Sal+Con A組，每組設(shè)3個復(fù)孔。Sal同T淋巴細胞孵育培養(yǎng)4 h后，加入終濃度為5 mg/L的Con A繼續(xù)作用8 h 后收集細胞。PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，重懸于PBS中，加入anti-mouse CD3-PE和anti-mouse CD69-FITC(終濃度為1 μg/106cells)，混勻后室溫避光染色30 min，PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2次，立即上流式細胞儀檢測。

3.4CFDA-SE染色法檢測小鼠T淋巴細胞增殖情況 調(diào)整細胞密度為1×1010/L，加入CFDA-SE工作液(終濃度為1 μmol/L)，充分混勻，于室溫避光輕輕振蕩10 min。用等體積RPMI-1640培養(yǎng)液終止染色，離心(250×g，4 ℃，5 min)，棄上清，相同條件洗滌細胞2 次后，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸，并調(diào)整細胞密度為3×109/L。實驗分組：control組、Con A組和Sal+ Con A組，每組設(shè)3個復(fù)孔。Sal同T淋巴細胞孵育培養(yǎng)4 h后，加入終濃度為5 mg/L的Con A繼續(xù)作用72 h 后收集細胞，上流式細胞儀檢測。

3.5H2DCFDA熒光探針檢測小鼠T淋巴細胞胞內(nèi)ROS的生成量 實驗分組：control組和單純藥物(Sal)組，每組設(shè)3個復(fù)孔。Sal同T淋巴細胞孵育培養(yǎng)48 h后，棄細胞培養(yǎng)板內(nèi)上清液，再用板內(nèi)PBS 清洗細胞后棄上清。用200 μL終濃度為5 μmol/L的H2CFDA將細胞重懸。將細胞懸液于室溫避光染色30 min，2 mL PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，棄去上清，用200 μL的PBS將細胞重懸，且立即上流式細胞儀檢測。

3.6DIOC6(3)染色檢測不同濃度Sal對T淋巴細胞線粒體活性的影響 實驗分組：control組和單純藥物(Sal)組，且每組設(shè)3個復(fù)孔。Sal同T淋巴細胞孵育培養(yǎng)48 h后，棄細胞培養(yǎng)板內(nèi)上清液，再用板內(nèi)PBS 清洗細胞后棄上清。用200 μL終濃度為20 nmol/L的DiOC6(3) 將細胞重懸。將細胞懸液于室溫避光染色30 min，加2 mL PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，棄去上清，用200 μL的PBS將細胞重懸，立即上流式細胞儀檢測。

3.7DiOC6(3)染色檢測DEX 誘導(dǎo)作用下Sal對T淋巴細胞線粒體膜電位的影響 實驗分組：control組、DEX組和Sal+DEX組，且每組設(shè)3個復(fù)孔。調(diào)整密度為3×109/L的細胞懸液，接種在96孔板中，每孔190 μL，加入10 μL Sal工作液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中待藥物作用4 h后，加入1 μL濃度為100 μmol/L的地塞米松，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，用2 mL PBS洗滌2 次(250×g，4 ℃，5 min)，棄去上清，用200 μL終濃度為20 nmol/L的DiOC6(3) 將細胞重懸。將細胞懸液于室溫避光染色30 min，PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，棄去上清，用200 μL的PBS將細胞重懸，立即上流式細胞儀檢測。

3.8小鼠胸腺T淋巴細胞懸液的制備 取3～4周齡BALB/c小鼠，斷頸處死，浸泡于75%乙醇中進行消毒，無菌分離胸腺組織，在含有PBS的無菌平皿中去掉被膜，于200目尼龍網(wǎng)研磨過濾，收集細胞，PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2次。用含10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液將胸腺細胞重懸，并調(diào)整細胞密度為3×109/L，即得胸腺細胞懸液。

3.9流式細胞術(shù)檢測Sal 對DEX誘導(dǎo)作用下胸腺T淋巴細胞凋亡的影響 實驗分組：control組、DEX組和Sal+DEX組，且每組設(shè)3個復(fù)孔。調(diào)整胸腺T淋巴細胞懸液接種于96 孔板，每孔190 μL體系。加入10 μL Sal工作液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中待藥物作用4 h后，加入終濃度為10-7mol/L的DEX。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，收集細胞，用PBS洗滌2 次(250×g，4 ℃，5 min)，棄去上清，用200 μL終濃度為20 nmol/L的DiOC6(3) 將細胞重懸。將細胞懸液于室溫避光染色30 min，PBS離心(250×g，4 ℃，5 min)洗滌細胞2 次，棄去上清，用200 μL 的PBS將細胞重懸，立即上流式細胞儀檢測。

3.10流式細胞術(shù)檢測及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 全部數(shù)據(jù)經(jīng) FACSCalibur、FACSAria 型流式細胞儀和 CellQuest、FACSDivaTM軟件獲取，獲得的數(shù)據(jù)用CellQuest、 ModFit LT 3.2和FCS Express 3.0軟件進行分析。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示，組間均數(shù)比較則采用單因素方差分析(one-way ANOVA)結(jié)合Student-Newman-Keulsq檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度Sal對小鼠T淋巴細胞體外細胞活力的影響

采用MTT法檢測Sal對小鼠T淋巴細胞存活的影響。結(jié)果顯示，終濃度分別為80、160及320 μmol/L的Sal同原代小鼠T淋巴細胞共孵育48 h后所得的細胞存活率都在90%以上，且與control組相比，無顯著差異，見表1。這一結(jié)果表明，實驗所選濃度范圍內(nèi)Sal對小鼠T淋巴細胞活力的毒性影響較小。

表1 MTT法檢測不同濃度Sal對小鼠T淋巴細胞體外存活率的影響

2 Sal對Con A誘導(dǎo)作用下小鼠T淋巴細胞 CD69 分子表達水平的影響

小鼠淋巴結(jié)T細胞在靜息狀態(tài)下很少表達CD69；經(jīng)單純Con A誘導(dǎo)T淋巴細胞8 h后， Con A組中表達 CD69 的 T淋巴細胞百分率顯著增加，與對照組相比較差異顯著(P<0.01)；實驗所用各濃度Sal均能升高 Con A 誘導(dǎo)的T細胞 CD69的表達水平，且呈一定的劑量依賴關(guān)系，其中，320 μmol/L Sal能明顯提高T淋巴細胞CD69的表達水平，與Con A相比較差異顯著(P<0.01)，見圖1、表2。

Figure 1. Effects of Sal on the expression of CD69 on activatited T lymphocytes in response to Con A stimulus.

表2 Sal對Con A刺激的T淋巴細胞CD69表達的影響

△△P<0.01vscontrol group；*P<0.05,**P<0.01vsCon A group.

3 Sal 對ConA 誘導(dǎo)作用下T淋巴細胞體外增殖的影響

CFDA-SE標(biāo)記技術(shù)利用活細胞染料CFDA-SE隨細胞每增殖一代后，其熒光強度減半的原理，結(jié)合流式細胞術(shù)可動態(tài)追蹤分析淋巴細胞增殖。用ModFit LT 3.2軟件擬合后，我們計算得出各代細胞所占的百分率及增殖指數(shù)(proliferation index，PI)，即增殖后的細胞總數(shù)與增殖前的細胞總數(shù)的比值。CFDA-SE標(biāo)記的T淋巴細胞經(jīng)Con A誘導(dǎo)刺激72 h后增殖一次的代表性結(jié)果見圖2，正常對照組僅見一個親代峰，無增殖峰，未出現(xiàn)CFDA-SE熒光強度減弱；經(jīng)Con A誘導(dǎo)刺激72 h后， Con A對照組的細胞出現(xiàn)4 個子代峰；而加入80、160及320 μmol/L的Sal后，各藥物組內(nèi)細胞分裂的代數(shù)及PI值均有增長(P<0.01)，見表3。

4 Sal 對小鼠T淋巴細胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

H2DCFDA 作為一種活細胞染料，它在進入活細胞膜內(nèi)能夠被細胞內(nèi)酯酶作用并轉(zhuǎn)化生成為H2DCF，而后者對細胞內(nèi)各類ROS敏感且極容易被其氧化并生成2’，7’-dichloroflurorescein，該產(chǎn)物具有強熒光特性，通常結(jié)合熒光顯微鏡或流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS水平，根據(jù)平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)的變化來表示細胞內(nèi)ROS生成量的改變。結(jié)果顯示，各濃度Sal與T淋巴細胞共孵育作用48 h后均能顯著降低T淋巴細胞胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)量，其MFI值與control組相比顯著降低 (P<0.05)，見圖3。

5 不同濃度Sal對T淋巴細胞線粒體活性的影響

DiOC6(3)是一種親脂性熒光染料，它能夠與活細胞線粒體發(fā)生結(jié)合，其結(jié)合過程依賴于線粒體自身的膜電位水平,線粒體膜電位的變化又反映線粒體的自身活性，即線粒體膜穩(wěn)定性所處的狀態(tài)。一旦線粒體膜穩(wěn)定性變差，即線粒體膜通透性增高致使細胞趨向發(fā)生凋亡。通常在流式細胞術(shù)結(jié)果中DiOC6(3)的MFI發(fā)生左移往往是意味著細胞線粒體膜穩(wěn)定性變差。本次實驗結(jié)果顯示，單獨Sal作用于T淋巴細胞均能夠明顯提高其線粒體膜電位水平，且與control組相比較差異顯著(P<0.01)，且呈一定劑量依賴關(guān)系，見圖4。

Figure 2. Effects of Sal on the proliferation of T cells stimulated by Con A for 72 h.

表3 Sal對Con A誘導(dǎo)72 h條件下T淋巴細胞體外增殖的影響

Parent: parent cells; G: the cells at different generations; PI: proliferation index.**P<0.01vsCon A group.

6 Sal對DEX誘導(dǎo)作用下小鼠 T淋巴細胞線粒體膜電位的影響

我們分別用終濃度為80 μmol/L、160 μmol/L和320 μmol/L的Sal與T淋巴細胞共孵育4 h，然后再用DEX體外誘導(dǎo)T淋巴細胞24 h，結(jié)果顯示，DEX組DiOC6(3)的MFI值與control組相比顯著降低(P<0.01);各濃度Sal在DEX誘導(dǎo)條件下能顯著提升T淋巴細胞內(nèi)線粒體膜電位水平(P<0.01),見圖5。

7 Sal 對DEX誘導(dǎo)作用下小鼠胸腺T淋巴細胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，control組內(nèi)胸腺T淋巴細胞發(fā)生凋亡率為(19.36±1.91)%，而經(jīng)DEX誘導(dǎo)后，胸腺T淋巴細胞的凋亡比率上升至(35.48±2.13)%，與control組相比顯著升高(P<0.01);終濃度為80 μmol/L、160 μmol/L和 320 μmol/L的Sal均可以明顯降低DEX誘導(dǎo)的胸腺T淋巴細胞凋亡，其細胞凋亡率分別為(31.34±3.57)%、(28.99±2.54)%和(24.47±2.03)%(P<0.01)，見圖6。

討 論

T淋巴細胞源自機體骨髓中的淋巴樣前祖細胞，它在胸腺中發(fā)育成熟，并具有高度的異質(zhì)性。它介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，在T細胞依賴性抗原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。我們知道，T淋巴細胞在執(zhí)行特異性免疫應(yīng)答過程中，可分為3個階段：(1)T淋巴細胞特異性識別抗原階段；(2)T淋巴細胞活化、增殖和分化階段；(3)效應(yīng)T淋巴細胞的產(chǎn)生和效應(yīng)階段。幾乎所有免疫相關(guān)病癥的發(fā)生、發(fā)展均與T淋巴細胞行為的改變相關(guān)。而T淋巴細胞行為改變的程度又可直接影響著特異性免疫應(yīng)答的模式、強弱和結(jié)果。例如，在機體感染病原微生物過程中，T淋巴細胞在識別特異性抗原后能否發(fā)生快速細胞活化和增殖這一事件是影響機體免疫系統(tǒng)對外界抗原進行免疫防御和免疫應(yīng)答功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。另外，T淋巴細胞的自身活性又是影響T淋巴細胞發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。當(dāng)T淋巴細胞因過度活化而發(fā)生大量凋亡時，通常會引起機體對外界病原微生物等抗原物質(zhì)進行特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力下降。因此，保護機體T淋巴細胞行為對增強機體對特異性抗原的應(yīng)答能力以及預(yù)防和控制相關(guān)感染性疾病的發(fā)生具有重要意義。

Figure 3. Effects of Sal on the production of ROS from T-lymphocytes. Mean±SD．n=3．△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group.

Figure 4. Effects of Sal on the mitochondrial activity in T-lymphocytes. Mean±SD．n=3．△△P<0.01vscontrol group.

Figure 5. Effects of Sal on the mitochondrial membrane potential of T-lymphocytes stimulated by DEX. Mean±SD．n=3.△△P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDEX group.

紅景天苷是從傳統(tǒng)藏藥紅景天根部提取出來的一種具有苯酚化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物[1],它作為傳統(tǒng)藏藥廣泛應(yīng)用于抗炎[2]、抗氧化[3]和抗疲勞等方面的治療。我們已在前期實驗中證實了Sal對小鼠腹腔巨噬細胞體外增殖、凋亡、吞噬、ROS和 NO產(chǎn)生等方面均有一定作用[5]。而在Sal與T淋巴細胞研究方面，目前已有文獻表明，Sal對某些動物模型體內(nèi)T淋巴細胞型別轉(zhuǎn)換及相關(guān)細胞因子調(diào)節(jié)具有一定的作用[4-7]，但Sal對小鼠原代T淋巴細胞體外行為的影響卻鮮有報道。因此，我們通過分析Sal小鼠T淋巴細胞體外活化、增殖、ROS及凋亡的影響，評價其可能的免疫效應(yīng)及作用機制。

Figure 6. Effects of Sal on apoptosis of thymus T cells in response to DEX. Mean±SD．n=3.△△P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDEX group.

Con A是一種重要的多克隆刺激劑，其作用于T淋巴細胞表面的TCR/CD3復(fù)合體而誘導(dǎo)T淋巴細胞的活化及增殖?；罨腡淋巴細胞表面表達早期活化表面分子CD69，它是T淋巴細胞活化后最早表達的表面分子，在多克隆刺激劑Con A作用下，T淋巴細胞會迅速活化，即T淋巴細胞經(jīng)ConA刺激后30～60 min即可檢到CD69 mRNA，2～3 h表達于T淋巴細胞表面，18～24 h表達量達到高峰。以CD69的表達水平作為T淋巴細胞的早期活化標(biāo)志來研究體外干預(yù)對T淋巴細胞活化的影響是重要的免疫學(xué)研究方法。本實驗結(jié)果表明，通過對小鼠T淋巴細胞表面分子CD69表達百分率變化的檢測，Sal能夠促進Con A刺激下T淋巴細胞表面分子CD69的表達。這為Sal促進T淋巴細胞早期活化提供了直接證據(jù)，并可能對細胞活化后的細胞增殖等行為的影響提供實驗依據(jù)。

初始T淋巴細胞在病原微生物或免疫刺激原刺激下迅速活化，被活化的T淋巴細胞迅速進入細胞周期，并通過有絲分裂大量增殖，并進一步分化成為效應(yīng)T 淋巴細胞并快速增殖，然后離開淋巴器官隨血液循環(huán)到達特異性抗原聚集部分執(zhí)行其免疫效應(yīng)功能。因此本研究中，我們選用CFDA-SE染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測Sal對Con A刺激下小鼠T淋巴細胞增殖的影響。實驗結(jié)果表明，Sal 對 Con A 誘導(dǎo)的細胞增殖有明顯的促進作用，可顯著增加細胞的增殖指數(shù)及子代細胞所占的比例，并且呈劑量依賴性。謝樂斯等[8]研究表明，Sal具有類絲裂原樣效應(yīng)，可增強T淋巴細胞介導(dǎo)的特異性免疫。這與我們結(jié)果相一致。但Sal對促進小鼠T 淋巴細胞增殖的機制尚未有研究表明，還有待進一步探討。

ROS能夠起始細胞的凋亡級聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)細胞產(chǎn)生過量ROS往往導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡或壞死[9]。而細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程。本研究分別以H2DCFDA染色法和DiOC6(3)染色結(jié)合流式細胞術(shù)分析Sal 對 T 細胞ROS產(chǎn)生和對細胞胞內(nèi)線粒體膜電位的影響。結(jié)果表明，Sal的長時間作用能夠使T淋巴細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量降低。同時，Sal亦能夠通過加強線粒體膜的穩(wěn)定性來抑制 DEX誘導(dǎo)T淋巴和胸腺細胞的凋亡。前人研究表明，Sal能清除機體內(nèi)不同種類的超氧陰離子自由基和羥基自由基[10-11]。本研究結(jié)果與文獻研究結(jié)果相一致，但Sal在抑制T淋巴細胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生以及保護細胞凋亡方面中所參與的環(huán)節(jié)尚未清楚，還需進一步工作加以證實。

綜上所述，Sal能夠明顯提高小鼠T淋巴細胞的活性，促進T淋巴細胞的體外活化和增殖，抑制細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生以及DEX誘導(dǎo)的T淋巴細胞和胸腺細胞的凋亡。但Sal在抑制T淋巴細胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及保護細胞免于凋亡方面所參與的環(huán)節(jié)尚未清楚，還需我們進一步工作加以證實。