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(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.杭州動物園)

弓形蟲病是一種由剛地弓形蟲(Toxopasmagondii)感染引起的的專性細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲病，呈世界性分布。其宿主范圍十分廣泛，能感染包括人類在內(nèi)的所有溫血脊椎動物的有核細(xì)胞，故為人獸共患寄生蟲病[1]。弓形蟲最早于1908年由Nicolle和Manceaux在北非突尼斯的嚙齒類梳趾鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已分布于世界各地[2]。據(jù)統(tǒng)計，1985～2006年期間我國貓弓形蟲感染率在14.06%～78%之間[3]。弓形蟲在人群中的感染率相當(dāng)高，全球約三分之一的人口被弓形蟲感染，我國人群弓形蟲血清抗體平均陽性率為7.88%[4，5]。人或動物誤食被弓形蟲卵囊、包囊、速殖子等污染的食物或者水，均有可能感染弓形蟲[6,7]。弓形蟲對人和動物危害嚴(yán)重，可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、死胎、先天性畸形，也會造成免疫力低下[8]。動物慢性感染時一般無明顯癥狀，這不僅給患病動物的診斷帶來極大的困難，而且對公共安全存在潛在的威脅，因此，無論是就流浪貓本身的健康而言，還是考慮到景區(qū)游客健康，對西湖風(fēng)景名勝區(qū)流浪貓弓形蟲感染情況的調(diào)查顯得尤其重要。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 ID Screen toxoplasmosis indirect Multi-species試劑盒，IDvet innovative Diagnostics。TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒，天根生物有限公司。弓形蟲PCR檢測試劑盒，世紀(jì)元亨生物有限公司。

1.1.2采用儀器及器材 酶標(biāo)儀購自Molecular Devices公司、Eppendorf排槍、Eppendorf移液槍(10 μL，200 μL，1000 μL)、恒溫箱、Eppendorf 14000 rpm小型離心機(jī)、蘇凈安泰雙人超凈臺，Scilogex 震蕩儀，國華數(shù)顯恒溫水浴鍋，Applied Biosystem Veriti型基因擴(kuò)增儀，君意JY04S凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD POWERPAC電泳系統(tǒng)。

1.1.3樣本采集及處理 在2016～2017年期間共抽樣采集杭州動物園、孤山公園、杭州少兒公園、虎跑公園內(nèi)流浪貓34份血清樣本，19份全血樣本以及杭州動物園、孤山公園、六和塔公園、杭州少兒公園四處的環(huán)境樣本33份。血清置-20℃冰箱，全血和環(huán)境樣本置-40℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.2方法

1.2.1間接酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)法 用于分析檢測血清樣本中弓形蟲抗體IgG。

1.2.1.1原理 用包被好弓形體P30抗原的微量板與樣本中的抗體結(jié)合形成“抗原-抗體”復(fù)合物。若存在抗體，則呈現(xiàn)顯色反應(yīng)；若不存在抗體則不呈現(xiàn)任何顯色反應(yīng)，呈色反應(yīng)與樣本中抗體含量成正比。在450 nm波長檢測OD值，計算每個樣本(S/P)的百分比，即(S/P)%=(OD樣本-OD陰性對照)/(OD陽性對照-OD陰性對照)。當(dāng)(S/P)%≤40%時為陰性，當(dāng)40%<(S/P)%<50%時為可疑，當(dāng)(S/P)%≥50%時為陽性。

1.2.1.2檢測步驟 樣本準(zhǔn)備、洗滌液準(zhǔn)備、酶結(jié)合物準(zhǔn)備、檢測、測OD值。

1.2.2分子生物學(xué)鑒定方法 用于分析檢測全血及環(huán)境樣本中的弓形蟲抗原。

1.2.2.1全血樣本中基因組DNA提取 根據(jù)TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒提取動物全血樣本中的DNA。

1.2.2.2環(huán)境樣本中DNA提取 取1 g貓糞于水中充分混勻,離心去除上清。加入sheather’s 浮選液，將沉淀懸浮，混勻，低速離心除去非蟲卵成分。取蟲卵懸浮液，加水稀釋后，高速離心，獲得蟲卵沉淀。

向蟲卵分離物沉淀加入細(xì)胞裂解液與微型玻璃珠，在渦旋震蕩儀上震蕩破碎蟲卵，釋放蟲卵內(nèi)DNA。按照離心柱小提DNA的方法提取DNA。

1.2.2.3PCR擴(kuò)增 分別用弓形蟲PCR檢測試劑盒中特異性上下引物對陽陰性對照物和全血和環(huán)境樣本的DNA PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 45 sec，57℃ 30 sec，72℃ 1 min，32個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.2.4電泳 配制1×TAE 電泳液若干，加入Gene Greed染液后制膠。然后取10 μL PCR擴(kuò)增物在1.5%的瓊脂糠凝膠上電泳30 min，最后通過凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1弓形蟲抗體檢測結(jié)果 流浪貓血清樣本弓形蟲抗體IgG檢測結(jié)果，收集了34份流浪貓血清樣本，流浪貓來源于生活在動物園(21份)、孤山(7份)、少兒公園和虎跑公園(6份)景區(qū)內(nèi)，總的陽性檢測率為20.59%(表1)，通過采集樣本的季節(jié)性分析，春季(4/6)66.67%、夏季(2/10)20.00%、秋季(1/12)8.33%、冬季(0/6)0.00%(表2)。

表1 流浪貓弓形蟲血清學(xué)檢測情況

表2 流浪貓血清樣本弓形蟲抗體IgG季節(jié)性分析

2.2抗原檢測結(jié)果

2.2.1全血樣本抗原檢測結(jié)果 部分全血樣本PCR分析結(jié)果，流浪貓共檢測19份，其中動物園的12份、孤山的7份，均為陰性(表3)。

表3 流浪貓全血PCR分析結(jié)果

2.2.2環(huán)境樣本抗原檢測結(jié)果 分別對動物園、孤山、六和塔、少兒公園和虎跑六處環(huán)境進(jìn)行取樣分析，共采集了33個樣本，主要是在冬季(12至次年2月)采集的，其中動物園14份，孤山8份、六和塔3份、少兒公園5份、虎跑公園3份。在動物園有一份樣本檢測出陽性(見圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

3.1貓是弓形蟲的終宿主，在貓小腸上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裂殖體增殖和配子生殖，最后形成卵囊，隨貓糞排出體外，卵囊在外界環(huán)境中經(jīng)過孢子增殖發(fā)育為含有兩個孢子囊的感染性卵囊[9]。人類可以通過接觸感染弓形蟲的貓，食被感染的生肉或未完全煮熟的肉，或者通過胎盤由母體垂直傳播而感染弓形蟲，還可以通過接觸被弓形蟲陽性貓糞便污染的寵物而感染[10]?，F(xiàn)在游客投喂流浪貓的現(xiàn)象越來越普遍，因此，與游客關(guān)系密切的流浪貓，在弓形蟲的傳播過程中起著非常重要的作用 ，充分了解流浪貓的弓形蟲發(fā)病及感染情況都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3.2弓形蟲感染后IgG抗體在血液中一般1～2周出現(xiàn)陽性，3～5周抗體效價達(dá)到高峰，并可維持時間長，健康帶蟲者可長期保持IgG抗體[11]。從流浪貓分子生物學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其陽性率均比較低，但弓形蟲抗體IgG的陽性率為20%以上，這原因可能以弓形蟲生活史有關(guān)，也有可能以取樣的數(shù)量有關(guān)，還需要進(jìn)一步分析。血清弓形蟲抗體IgG在體內(nèi)維持時間較長，對于調(diào)查弓形蟲感染情況來講，相對于分子生物學(xué)檢測，采用ELISA法檢測動物血清抗體IgG是一個比較不錯的調(diào)查方法。

3.3通過分析西湖景區(qū)內(nèi)34份流浪貓血清弓形蟲抗體IgG情況，發(fā)現(xiàn)其與浙江省感染率調(diào)查結(jié)果[9]差不多，具有一定的相關(guān)性，而比北京市感染率30.3%[12]要低。其中孤山流浪貓陽性率為(4/7)42.86%，比動物園、虎跑公園和少兒公園的都高。這可能跟流浪貓的密度有一定的關(guān)系，密度越大，相互接觸傳染的可能性大，感染率也隨之變高。

3.4通過分析取樣季節(jié)，發(fā)現(xiàn)血清弓形蟲抗體IgG陽性率春季最高，為 66.67%；其次為夏季、秋季，冬季陽性率最低，在以后弓形蟲防治方面，春季最關(guān)鍵。同時弓形蟲抗體檢測結(jié)果與環(huán)境樣本分子生物學(xué)檢測的結(jié)果比較吻合，由于環(huán)境樣本在冬季比較好找，這次的樣本基本是在12、1、2月份取的樣，檢出率不高可能也有這方面原因。