高小躍，楊紅澎，張 怡，童應(yīng)凱

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)系 天津300384)

0 引 言

近年來(lái)，在日本和我國(guó)，酵素已成為電視、廣播、新聞等的熱門話題，成為保健食品的新寵。酵素是一類特殊的具有催化功能的復(fù)雜蛋白質(zhì)，部分由人體自身合成，部分由飲食補(bǔ)充[1]。新型酵素食品是指通過(guò)合理選擇食材、益生菌和發(fā)酵工藝，可分別形成一種或多種神奇功效，包括：調(diào)整免疫應(yīng)答、抗癌、整腸、消除便秘、減肥、抗過(guò)敏等，作為具有生命活力的獨(dú)特保健品，酵素有著巨大的養(yǎng)生前景。

紅薯，學(xué)名甘薯，原產(chǎn)于美洲，是世界上公認(rèn)的物美價(jià)廉、糧菜兼用、老少皆宜的健康綠色食品。紅薯味道甜美，富含碳水化合物，膳食纖維，胡蘿卜素，多種維生素以及鉀、鎂、銅、硒、鈣等多種礦物質(zhì)，具有抗癌防癌，防治高血壓、動(dòng)脈硬化，降低膽固醇，治療便秘的作用[2]。因此，研究新型紅薯食品是非常必要的。

酸棗仁是鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，分布于我國(guó)西北、東北、華北及南方一些地區(qū)。酸棗仁具有補(bǔ)肝、寧心、斂汗、生津的功效，用于治療虛煩不眠、驚悸多夢(mèng)、體虛多汗及津傷口渴[3]。因?yàn)樗釛椚舒?zhèn)靜催眠的顯著功效，使其受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，酸棗仁食品越來(lái)越受歡迎。

作為未來(lái)的保健品新星，酵素食品的發(fā)展前景遠(yuǎn)大，市場(chǎng)價(jià)值較高。由于我國(guó)對(duì)于酵素產(chǎn)品的研究起步較晚，國(guó)內(nèi)沒(méi)有針對(duì)酵素產(chǎn)品出臺(tái)相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量檢測(cè)等，導(dǎo)致市面上酵素產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊[4]。本文主要對(duì)以紅薯、酸棗仁為主要原料的一種新型酵素食品的發(fā)酵工藝研究開(kāi)展研究，確定其最佳發(fā)酵工藝條件，為大規(guī)模生產(chǎn)該類酵素食品提供借鑒，真正讓酵素食品作為保健食品走進(jìn)人們的生活。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與菌種

原料：市售紅薯、酸棗仁。

菌種：尚川酵素益生菌菌粉；植物乳桿菌；干酪乳桿菌；副干酪乳桿菌(佛山市樂(lè)伴貿(mào)易有限公司)。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0,g，牛肉粉 5.0,g，酵母粉4.0,g，葡萄糖20.0,g，吐溫80 1.0,mL，磷酸氫二鉀2.0,g，醋酸鈉 5.0,g，檸檬酸三銨 2.0,g，硫酸鎂 0.2,g，硫酸錳 0.05,g，瓊脂 15.0,g，pH 值 6.2，121,℃高壓滅菌 40,min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵素發(fā)酵工藝路線

紅薯→洗凈去皮、切塊→榨汁→ 過(guò)濾→分裝→滅菌→接種→發(fā)酵

酸棗仁→粉碎→烘干→加水煮沸→過(guò)濾→分裝→滅菌→接種→發(fā)酵

1.2.2 實(shí)驗(yàn)材料前處理方法

1.2.2.1 紅薯前處理方法

紅薯洗凈去皮后，切小塊，放入榨汁機(jī)中，按紅薯∶水為 1∶10比例榨汁；采用 32層紗布過(guò)濾，除去紅薯渣，按 100,mL/杯分裝入三角瓶中，于 121,℃高壓滅菌 20,min；滅菌結(jié)束，待培養(yǎng)基晾涼后，按正交實(shí)驗(yàn)表(見(jiàn)表1)進(jìn)行接種發(fā)酵。

1.2.2.2 酸棗仁前處理方法

酸棗仁于粉碎機(jī)中粉碎約 1～2,min，取粉末放入烘箱85,℃烘干8,h，按酸棗仁粉末∶水為1∶25比例煮沸5,min，采用 32層紗布過(guò)濾，除去粉末，按100,mL/杯分裝入三角瓶中，于121,℃高壓滅菌20,min；滅菌結(jié)束，待培養(yǎng)基晾涼后，按正交實(shí)驗(yàn)表(如表1)進(jìn)行接種發(fā)酵。

表1 L9(34)實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.3 測(cè)定方法

1.2.3.1 感官

觀察外觀、香氣、整體口感。

1.2.3.2 測(cè)定活菌(乳酸菌)總數(shù)

將發(fā)酵好的液體樣品充分搖勻后，用無(wú)菌移液管吸取樣品 25,mL放入裝有 225,mL無(wú)菌水的無(wú)菌三角瓶中，充分振搖，制成1∶10的樣品勻液。

用1,mL微量加樣器吸取1∶10樣品勻液1,mL，緩慢注入裝有 9,mL無(wú)菌水的無(wú)菌試管中(吸管尖端不要觸及稀釋液)，振搖試管，換用 1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成 1∶100的樣品勻液。另取 1支微量加樣器槍頭，按上述操作順序，做 10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋1次，即換用1次槍頭。

根據(jù)樣品活菌總數(shù)的估計(jì)，選擇 2～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取 0.1,mL樣品勻液分別置于 3個(gè) MRS瓊脂平板，使用涂布器進(jìn)行表面涂布。37,℃，厭氧培養(yǎng) 24,h后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板涂布要求在超凈工作臺(tái)內(nèi)遵循無(wú)菌操作，15,min內(nèi)完成。

1.2.3.3 pH值的測(cè)定

pH電極使用前用純水沖洗，用紙吸干水分，電極連接于儀表上，接通電源，開(kāi)機(jī)。

校準(zhǔn)：電極放入任意一pH緩沖液中，校準(zhǔn)，判斷讀數(shù)穩(wěn)定后，按確認(rèn)完成一點(diǎn)校準(zhǔn)；放入第 2個(gè)緩沖液按校準(zhǔn)繼續(xù)兩點(diǎn)校準(zhǔn)。

測(cè)量：用滴管吸取無(wú)菌水反復(fù)沖洗電極 3 次，用濾紙吸干表面液體，插入發(fā)酵好的液體樣品中進(jìn)行測(cè)定，判斷讀數(shù)穩(wěn)定后，按確定鍵讀數(shù)，記錄數(shù)值。

1.2.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定

超氧化物歧化酶，簡(jiǎn)稱 SOD。SOD 一類催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，消除體內(nèi)超氧陰離子自由基，消除活性氧毒性，保護(hù)機(jī)體不受超氧陰離子自由基攻擊的特殊金屬酶。研究表明，具有 SOD酶的保健品具有良好的抗衰老、抗疾病、抗癌、抗疲勞和保健強(qiáng)身的功效[5]。

鄰苯三酚方法原理：鄰苯三酚在酸性環(huán)境中穩(wěn)定，但在弱堿性環(huán)境中會(huì)發(fā)生自氧化反應(yīng)，鄰苯三酚在自氧化時(shí)只接受一個(gè)電子生成超氧陰離子自由基(O2+O2-)，并在其自氧化過(guò)程中以一定速率生成有色中間物，SOD 可以將 O2-歧化分解成 H2O2和 O2，從而抑制了鄰苯三酚的自氧化速率。每分鐘反應(yīng)液中SOD抑制50%,反應(yīng)速率時(shí)即為SOD活力單位[6]。

制備樣品提取物溶液：分別量取 100,μL的樣品溶液于 EP管中，加入 1,mL的 DMSO，充分溶解，備用。

0.1,mol/L tris溶液：稱tris 1.211,g加少許蒸餾水溶解，定容至100,mL。

0.1,mol/L HCl溶液：量濃鹽酸 50,μL 定容至50,mL。

tris-HCl緩沖液：量取50,mL的0.1,mol/L tris溶液與20,mL的0.1,mol/L HCl溶液混合，用濃鹽酸調(diào)pH值到8.2，再用蒸餾水定容至100,mL。

7,mmol/L C6H6O3溶液：稱 C6H6O30.441,4,g加水定容至100,mL。

試驗(yàn)中樣品組為 10,μL的樣品提取物溶液加入3,mL pH 值為 8.2的 tris-HCl緩沖液，25,℃水浴20,min，加入 7,mmo1/L的鄰苯三酚溶液 3,mL，反應(yīng)4,min后加入 28,μL 12,mmol/L的鹽酸終止反應(yīng)；空白組中不加樣品，其余與樣品組相同，樣品空白組不加鄰苯三酚并以水代替。以 tris-HC1緩沖液為對(duì)照在 420,nm測(cè)吸光度值。根據(jù)抑制率判斷樣品對(duì) O2-清除的能力。每份樣品重復(fù)測(cè)定3次。

式中：V1反應(yīng)液總體積；V2測(cè)定樣品體積；n樣品稀釋液倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官分析

外觀、香氣、整體口感如表2所示。

表2 感官結(jié)果Tab.2 Sensory results

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于本實(shí)驗(yàn)以活菌數(shù)高，SOD活性高為最終目標(biāo)，所以觀測(cè)指標(biāo)是以活菌數(shù)量和SOD酶活性為主。正交試驗(yàn)中加糖量是為了調(diào)節(jié)酵素口感，因此，考慮溫度、時(shí)間、接種量3個(gè)因素的影響，活菌數(shù)以及SOD活性測(cè)定數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 紅薯酵素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of sweet potato enzyme from L9(34)orthogonal experiment

2.2.1 紅薯酵素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各個(gè)因素的離差平方和 Si反映了各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，由表3可知，對(duì)于 SOD酶活力而言，SA＝0.007,1，SB＝0.000,1.SC＝0.007,6，SC＞SA＞SB。對(duì)活菌總數(shù)而言，SA＝0.169,1，SB＝0.002,6，SC＝0.237，SC＞SA＞SB。即影響因素順序?yàn)榻臃N量影響最大，發(fā)酵溫度影響次之，時(shí)間影響較小。

分析表4、表5。取臨界值 F0.05和 F0.10之間的作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于 SOD 酶活力，F(xiàn)0.05＞F0.10＞FA，F(xiàn)0.05＞F0.10＞FB，F(xiàn)C＞F0.05＞F0.10，對(duì)于活菌總數(shù)，F(xiàn)A＞F0.05＞F0.10，F(xiàn)0.05＞F0.10＞FB，F(xiàn)C＞F0.05＞F0.10，由方差分析可知，因素 A、B、C 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有顯著影響，其中，C因素影響特別顯著，因素 A、B次之。對(duì)于因素 D，因紅薯中富含碳水化合物，加糖量為2%,時(shí)，口感較佳，即可滿足大多數(shù)人口感。

表4 紅薯酵素SOD酶活力方差分析表Tab.4 Variance analysis of SOD enzyme activity of sweet potato enzyme

表5 紅薯酵素活菌總數(shù)方差分析表Tab.5 Analysis table of variance of total number of yeast living bacteria

2.2.2 酸棗仁酵素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表6中 Si值可知，對(duì)于 SOD酶活力而言，SA＝19.97，SB＝3.25，SC＝39.5，SC＞SA＞SB，即影響因素順序?yàn)榻臃N量影響最大，發(fā)酵溫度影響次之，時(shí)間影響較小。對(duì)活菌總數(shù)而言，SA＝0.240,4，SB＝0.004,6，SC＝0.208,6，SA＞SC＞SB。即影響因素順序?yàn)榘l(fā)酵溫度影響最大，發(fā)酵接種量影響次之，時(shí)間影響較小。

表6 酸棗仁酵素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Tab.6 The results of jujube kernel enzyme from L9(34)orthogonal experiment

分析表7、表8。取臨界值 F0.05和 F0.10之間的數(shù)值作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于 SOD 酶活力，F(xiàn)0.05＞F0.10＞FA，F(xiàn)0.05＞F0.10＞FB，F(xiàn)0.05＞F0.10＞FC，對(duì)于活菌總數(shù)，F(xiàn)A＞F0.05＞F0.10，F(xiàn)0.05＞F0.10＞FB，F(xiàn)C＞F0.05＞F0.10，由方差分析可知，因素A、B、C對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有顯著影響，其中，A因素影響特別顯著，因素C、B次之。由于因素A、C顯著性均大于B，因子A、C應(yīng)選擇活菌數(shù)及SOD值最高的A3、C3，因子B雖然在 B1時(shí) SOD酶活最高，但與 B2時(shí)相差不多，而B(niǎo)2時(shí)活菌數(shù)最高，所以選擇 B2，對(duì)于因素 D，在加糖量為4%,時(shí)，口感適中。

表7 酸棗仁酵素SOD酶活力方差分析表Tab.7 Variance analysis of SOD enzyme activity of jujube kernel enzyme

表8 酸棗仁酵素活菌總數(shù)方差分析表Tab.8 Variance analysis of the total number of active bacteria of jujube kernel enzyme

3 結(jié) 論

綜合方差分析及整體感官，紅薯酵素的發(fā)酵工藝條件為：溫度42,℃，發(fā)酵時(shí)間8,h，接種量為1.5%，加糖2%；配料比紅薯∶水為1∶10。酸棗仁酵素的發(fā)酵工藝條件為：溫度 42,℃，發(fā)酵時(shí)間 8,h，接種量為1.5%，加糖4%；配料比酸棗仁粉∶水＝1∶25。