張園 彭伯堅(jiān) 張擁軍 駱鳳嬌

【摘要】 目的：探討脂多糖對(duì)食管鱗狀上皮細(xì)胞的骨形態(tài)蛋白4（BMP4）表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)正常食管鱗狀上皮Het-1A細(xì)胞，采用不同濃度脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）處理細(xì)胞、實(shí)時(shí)熒光定量PCR與蛋白印跡分析方法測(cè)定BMP4及Smad1表達(dá)的變化，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：10 ng/mL LPS組可輕微刺激食管鱗狀上皮細(xì)胞表達(dá)BMP4、Smad1的表達(dá)，與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；100 ng/mL LPS組和500 ng/mL LPS組均明顯增強(qiáng)BMP4和Smad1的表達(dá)，且隨濃度增強(qiáng)效應(yīng)增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：脂多糖可能通過(guò)誘導(dǎo)BMP4及BMP信號(hào)通路相關(guān)蛋白Smad1的表達(dá)參與Barrett食管的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】 脂多糖； 食管鱗狀上皮細(xì)胞； BMP4； Barrett食管

【Abstract】 Objective：To explore the effect of Lipopolysaccharide on BMP4 expression in esophagus squamous cells.Method：Primary Het-1A cells were treated with Lipopolysaccharide at different concentration.The changes of expressions of BMP4 and Smad1 were examined by real time polymerase chain reaction and Western blot analysis.Result：10 ng/mL LPS group could slightly stimulate the expression of BMP4 and Smad1 in the squamous epithelial cells of the esophagus，there was no significant difference compared with the control group（P>0.05）.The expressions of BMP4 and Smad1 were obviously enhanced in the 100 ng/mL LPS group and the 500 ng/mL LPS group，and the difference was statistically significant with the enhancement of the concentration enhancement effect （P<0.05）.Conclusion：Lipopolysaccharide can regulate the expressions of BMP4 and Smad1，which may play a role in the development of Barrett oesophagus.

【Key words】 Lipopolysaccharide； Esophagus squamous cells； BMP4； Barrett esophagus

First-authors address：Huadu District Peoples Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510800，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.007

Barrett食管（BE）是指食管遠(yuǎn)端鱗狀上皮被化生的柱狀上皮取代的病理現(xiàn)象，是公認(rèn)的食管腺癌（EA）的癌前病變[1]。既往研究認(rèn)為，BE的病因主要為胃酸、膽汁酸、胃蛋白酶等反流物對(duì)食管上皮細(xì)胞慢性損傷的結(jié)果，但接近40%的BE患者無(wú)GERD癥狀發(fā)生[2-3]。近年來(lái)菌群失調(diào)在消化系統(tǒng)疾病中的作用得到廣泛重視，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，與正常食管相比，BE和食管炎末端形成量種截然不同的微生物類型，BE和食管炎末端包含大量微生物革蘭陰性菌（G-）占53.4%，而在正常食管黏膜中多為革蘭陽(yáng)性菌為代表的厚壁菌門(mén)，G-菌只占14.9%。由此筆者推測(cè)除胃酸和膽汁刺激外，菌群變化導(dǎo)致炎性因子LPS增高是BE發(fā)生的重要致病因素[4]。在正常成年人的食管黏膜中不表達(dá)的BMP4在BE和胃食管反流病的食管鱗狀細(xì)胞中表達(dá)異常上升[5]，而骨形成蛋白（BMP4）信號(hào)傳導(dǎo)通路激活可以誘導(dǎo)鱗狀上皮細(xì)胞向腸化柱狀上皮細(xì)胞的方向分化，是BE的標(biāo)志蛋白[6]。筆者推測(cè)LPS可激活BMP4信號(hào)傳導(dǎo)通路參與BE的發(fā)生和發(fā)展。本研究采用Real-time PCR、Western blot分別檢測(cè)經(jīng)過(guò)不同濃度LPS處理后，正常食管鱗狀上皮Het-1A細(xì)胞BMP4、Smad1的表達(dá)變化，探討LPS對(duì)BMP4及Smad1表達(dá)的影響，為深入認(rèn)識(shí)BE的發(fā)生發(fā)展提供新線索，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Het-1A細(xì)胞株購(gòu)自上海序潤(rùn)生命科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，脂多糖購(gòu)自sigam公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的互補(bǔ)DNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司，快速SYBR Green Master Mix試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司，引物由公司設(shè)計(jì)合成上海英駿生物技術(shù)有限公司，一抗BMP-4、Smad1/5、均購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 Het-1A食管上皮細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞經(jīng)消化傳代，以DMEM加15%的胎牛血清作為培養(yǎng)液，于5%CO2的37 ℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每周換液2～3次，待細(xì)胞密度達(dá)80%以上進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 LPS處理細(xì)胞 無(wú)血清及添加物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h。應(yīng)用無(wú)血清及添加物的培養(yǎng)基調(diào)制LPS濃度分別為10、100、500 ng/mL。應(yīng)用不同PLS濃度的培養(yǎng)基處理24 h，然后繼續(xù)以無(wú)血清及添加物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至24 h。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 處理后的細(xì)胞提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。GAPDH為內(nèi)參照物，BMP上游引物為5-AGGAAGCAGTCTGTGTAGTGTG-3，下游引物5-GATGTAGTAGAGGGATGTGGG-3；Smad1上游引物為5-CTGCCCTCAGAAATCAACAGAG-3，下游引物5-GTGAAACCATCCACCAACACAC-3；GAPDH上游引物為5-CCCTTCA TTGACCTCAACTACATGG-3，下游引物為5-CATGGTGGTGAAGACGCCAG-3。用2-ΔΔCt值分析各組細(xì)胞中BMP4、Smad1相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 蛋白印跡分析（Western blot） Western blot檢測(cè)細(xì)胞BMP4和Smad1蛋白表達(dá)：以GAPDH為內(nèi)參照物，將細(xì)胞裂解液加入至各組細(xì)胞中提取總蛋白，將蛋白溶液和上樣緩沖液按2︰1混合均勻，于沸水浴中加熱5 min。于SDS.PAGE系統(tǒng)中進(jìn)行上樣并電泳分離，轉(zhuǎn)印至PADF膜上，經(jīng)封閉、一抗（1︰10 000 Rabbit anti-GAPDH以及1︰1 000 Rabbit anti-BMP4、Smad1）和二抗（1︰5 000羊抗兔IgG/HRP）孵育后，將化學(xué)熒光發(fā)光底物均勻地添加至PADF膜的表面，持續(xù)反應(yīng)5 min。用試劑盒的濾紙除去PADF膜表面多余的底物溶液，放置于暗盒中進(jìn)行曝光并顯影定影。結(jié)果以不同濃度的BMP4、Smad1/5與GAPDH的吸光度比值代表各樣本BMP4、Smad1/5的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂多糖對(duì)Het-1A中BMP4表達(dá)的影響

2.1.1 BMP4 mRNA表達(dá) 在培養(yǎng)基濃度100 ng/mL LPS組和500 ng/mL LPS組中，食管鱗狀上皮細(xì)胞的BMP4 mRNA水平分別是對(duì)照組的2.20、3.59倍，效應(yīng)差異存在顯著性（P<0.05）。10 ng/mL LPS組BMP4 mRNA水平與對(duì)照組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.1.2 BMP4蛋白表達(dá) 正常食管鱗狀上皮細(xì)胞和低濃度10 ng/mL LPS組無(wú)不表達(dá)BMP4，100 ng/mL LPS組可促進(jìn)BMP4的表達(dá)，且隨濃度增強(qiáng)效應(yīng)增強(qiáng)，見(jiàn)表1和圖1。

2.2 脂多糖對(duì)Het-1A中Smad1表達(dá)的影響

2.2.1 Smad1 mRNA表達(dá) 對(duì)照組食管鱗狀上皮細(xì)胞和10 ng/mL LPS組 Smad1 mRNA均呈低水平表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而100 ng/mL LPS組和500 ng/mL LPS組基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，分別是對(duì)照組的1.73、2.56倍，效應(yīng)差異存在顯著性（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.2.2 Smad1蛋白表達(dá) 對(duì)照組和10 ng/mL LPS組均低表達(dá)Smad1，100 ng/mL LPS組可促進(jìn)BMP4的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2和圖1。

3 討論

近年來(lái)，大量研究顯示胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)失衡與人體疾病有著密切的關(guān)聯(lián)[7-8]。Gall等[9]發(fā)現(xiàn)在Barrett食管患者中，鏈球菌與普氏菌為其主要菌群，比值越大，Barrett食管發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高，并且與早期食管腺癌有明顯相關(guān)性。脂多糖（LPS），革蘭陰性菌主要的外膜結(jié)構(gòu)，能夠誘導(dǎo)宿主固有免疫反應(yīng)，通過(guò)激活Toll-4受體和NF-κB的途徑上調(diào)促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在反流性食管炎-BE-腺癌的進(jìn)展過(guò)程中，NF-κB的活性逐漸上調(diào)，并伴Cdx2的表達(dá)水平同時(shí)上調(diào)[11-12]。此外LPS能夠通過(guò)誘導(dǎo)一氧化氮合酶和延遲胃排空的環(huán)氧酶-2的生成使下食管括約肌松弛導(dǎo)致反流性食管炎[13-14]。目前，大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，食管化生過(guò)程與食管長(zhǎng)期暴露于胃酸、膽汁酸、胃蛋白酶等反流物等導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)[15-16]。但部分患者無(wú)反流癥狀，24 h pH檢測(cè)無(wú)明顯酸反流。因此筆者推測(cè)菌群變化LPS表達(dá)的升高可能通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致Barrett食管的發(fā)生，同時(shí)可通過(guò)松弛下食管括約肌和延遲胃排空促進(jìn)胃酸、膽汁酸、胃蛋白酶反流促進(jìn)疾病的演變。

BMP4可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)和分化，是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)分子。Smads是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，可直接由從細(xì)胞膜將BMP4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)[17]。目前BE食管的具體化生過(guò)程仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，BMP參與CDX2的調(diào)控，通過(guò)促CDX2的表達(dá)影響B(tài)e的形成[18]。

研究中筆者發(fā)現(xiàn)，正常食管鱗狀上皮細(xì)胞并不表達(dá)BMP4，10 ng/mL LPS組培養(yǎng)基可輕微刺激BMP4表達(dá)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而100 ng/mL LPS組和500 ng/mL LPS組則明顯增強(qiáng)BMP4表達(dá)（P<0.05）。提示，LPS可以促進(jìn)食管鱗狀上皮細(xì)胞BMP4的表達(dá)，而且LPS濃度與BMP4表達(dá)強(qiáng)度正相關(guān)。正常食管鱗狀上皮細(xì)胞Smad1表達(dá)較低，而LPS可促進(jìn) Smad1表達(dá)，且LPS濃度與Smad1表達(dá)強(qiáng)度正相關(guān)。而Smad1表達(dá)增強(qiáng)可促進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的BMP4信號(hào)傳遞，并且激發(fā)后續(xù)的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，促進(jìn)BE的化生[19-20]。

綜上，LPS可通過(guò)BMP4和BMP4通路蛋白Smad1表達(dá)參與BE的發(fā)生。探索了BE發(fā)生和BMP4在BE上調(diào)的可能機(jī)制。益生菌的治療可能通過(guò)抑制LPS預(yù)防BE甚至食管腺癌發(fā)生。但結(jié)論仍需進(jìn)一步研究證實(shí)，如LPS影響B(tài)MP4表達(dá)的具體分子機(jī)制，LPS與酸及膽鹽之間的關(guān)系等，由于Barrett食管是多種復(fù)合事件共同作用于食管黏膜層面的結(jié)果，因此需要綜合更多方面因素進(jìn)行深層次研究。

參考文獻(xiàn)

[1]楊小平.食管癌及Barrett食管的發(fā)病趨勢(shì)、流行病學(xué)、內(nèi)鏡及病理特征分析[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2015.

[2]夏一菊.KLF5在DCA介導(dǎo)下誘導(dǎo)食管鱗狀上皮向柱狀上皮轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2016.

[3] Sharma N，Ho K Y.Risk factors for Barretts Oesophagus[J].Gastrointest Tumors，2016，3（2）：103-108.

[4]劉寶珠，李曉藝.Barrett食管32例臨床病理分析[J].基層醫(yī)學(xué)論壇，2016，20（26）：3700-3701.

[5]崔曼莉，王景杰，張明鑫.微生態(tài)在食管疾病中的意義[J].世界華人消化雜志，2018，26（5）：289-295.

[6]楊浩羿.CDX2、BMP4在Barrett食管及食管腺癌中的表達(dá)及意義[D].貴陽(yáng)：貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，2015.

[7]閆武.BMP4信號(hào)通路與KLF4在Barrett食管形成中的作用研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2016.

[8]戴瓊，顧思嵐，石鼎，等.人體腸道微生態(tài)與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2016，28（5）：614-617.

[9]沈小雪，俞汀，林琳.胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)與胃食管反流病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)，2017，22（4）：245-248.

[10] Gall A，F(xiàn)ero J，McCoy C，et al.Bacterial composition of the human upper gastrointestinal tract microbiome is dynamic and associated with genomic instability in a Barretts esophagus cohort[J].PLoS One，2015，10（6）：e0129055.

[11]劉利，解啟蓮，李小雙.亞低溫抑制BV-2細(xì)胞脂多糖誘導(dǎo)的Toll樣受體4活化和炎癥因子表達(dá)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31（11）：1479-1482.

[12]王少鑫，靳寶鋒，崔立紅.錨蛋白重復(fù)序列通過(guò)NF-κB信號(hào)通路參與腸炎相關(guān)腫瘤的調(diào)控[J].世界華人消化雜志，2015，23（2）：189-195.

[13]楊建杰，張玉林.COX2、CDX2在糜爛性食管炎、Barrate食管及食管腺癌中的表達(dá)及意義[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14（11）：1621-1623.

[14]郭曉燕，王婷，董蕾，等.一氧化氮合酶在胃食管反流病患者食道黏膜的表達(dá)[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2015，36（3）：373-377.

[15]肖蘭.一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素-8在不同類型胃食管反流病中的表達(dá)及意義[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2017，46（6）：778-780.

[16]戴結(jié).EGCG抑制胃食管反流物誘導(dǎo)的人食管上皮細(xì)胞NF-κB激活的研究[D].南京：南京大學(xué)，2013.

[17]陳志浩，李政奇，王貴齊.食管腺癌發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥的相關(guān)性研究[J].中國(guó)腫瘤，2017，26（9）：721-726.

[18]吳倩倩，孫琦，黃勤，等.TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與胃癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)，2015，20（1）：55-57.

[19]房渝，陳浩，陳曉欣.Barrett食管發(fā)生的分子機(jī)制[J].中華消化內(nèi)鏡雜志，2011，28（8）：428-431.

[20]李萍英.Barrett食管的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].青海醫(yī)藥雜志，2012，42（3）：93-96.

[21]房殿春.Barrett食管發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2012，17（2）：89-92.