王喆，王蕊 ，陳思涵，范穎，滿朝新，姜毓君,b

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150030）

0 引言

乳酸菌是對(duì)人體有著多種益生功能的微生物，同時(shí)也是組成先天性免疫系統(tǒng)重要的部分，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的過(guò)程中是不可缺少的[1]。乳桿菌作為重要的益生菌來(lái)源，主要是在腸黏膜上發(fā)揮其作用，所以其對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附能力是其發(fā)揮益生作用重要的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。益生乳桿菌通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物菌群[4-5]，以及直接對(duì)固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，以達(dá)到預(yù)防和治療相關(guān)疾病，調(diào)節(jié)免疫功能的效果[6-7]。本研究選擇了從西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離得到的4株乳桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)其對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附能力研究比較，從中選出一株有較強(qiáng)粘附能力的植物乳桿菌，對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究，找到其在機(jī)體免疫功能方面的證據(jù)，為后續(xù)更科學(xué)地把這株植物乳桿菌應(yīng)用于開(kāi)發(fā)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)乳制品提供相關(guān)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株、細(xì)胞及動(dòng)物

干酪乳桿菌TD 085，植物乳桿菌TD 109，植物乳桿菌TD 113，嗜酸乳桿菌TD 124，分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品。

人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2，昆明系小白鼠。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

M RS培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖20.0 g，Tw een-80 1.0 m L，硫酸錳0.25 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g；蒸餾水定容至1 000m L，調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃高壓滅菌15 min，4℃保存。

DM EM細(xì)胞培養(yǎng)液：高糖DM EM 900 m L，胎牛血清100 m L，鏈霉素100μg/m L，青霉素100 U/m L，0.22μm無(wú)菌濾器過(guò)濾，4℃保存。

RPM I1640完全培養(yǎng)液：RPM I1640培養(yǎng)液過(guò)濾除菌，使用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺200 mm ol/L，青霉素100 U/m L，鏈霉素100 ug/L，用無(wú)菌的1 m ol/L的HC l或1 m ol/L的N aOH調(diào)pH至7.0～7.2，4℃保存。

小鼠白介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子（TNF-α）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

M TT、ConA、無(wú)菌Hank's液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS），異丙醇，氫氧化鈉，鹽酸，氯化鈉，碳酸氫鈉，臺(tái)盼藍(lán)等。

1.1.3 儀器和設(shè)備

BCN 1360型生物潔凈工作臺(tái)，HF90型CO2培養(yǎng)箱，DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，低溫冷凍離心機(jī)，高壓蒸汽滅菌鍋，酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 菌體對(duì)細(xì)胞的黏附作用

1.2.1.1 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞在含有10%的胎牛血清、100 U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素的高糖DM EM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，在37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞單層生長(zhǎng)到覆蓋培養(yǎng)瓶表面80%左右時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞，0.25%胰酶消化，以1∶2的比例進(jìn)行傳代后，然后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，傳4代左右進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.2 乳桿菌的培養(yǎng)

分別將四株乳酸菌于MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)36～48 h后分別挑取單菌落培養(yǎng)于液體M RS培養(yǎng)基，12 h后，按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，傳3代后即為實(shí)驗(yàn)菌株。

1.2.1.3 細(xì)胞與菌體的共培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞以每孔1×106個(gè)的濃度接種于6孔板，連續(xù)培養(yǎng)至極化狀態(tài)（18～21 d），此時(shí)加入菌體共培養(yǎng)。離心后棄上清，將菌體用無(wú)菌PBS洗滌3次，轉(zhuǎn)速為8 000 r/m in，4℃離心5 min，將菌體重懸于PBS即為實(shí)驗(yàn)所需菌體。將重懸好的菌體以108個(gè)/孔的量加入到六孔板中，每株菌做3個(gè)平行孔，在37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)4 h。用保存在4℃的PBS將實(shí)驗(yàn)組（乳桿菌作用）和對(duì)照組（無(wú)乳桿菌作用）的Caco-2細(xì)胞沖洗3次，將未粘附的菌體洗脫，隨后用胰酶消化收集細(xì)胞，進(jìn)行稀釋涂布平板計(jì)數(shù)，計(jì)算菌體的黏附率。

1.2.2 免疫指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1 動(dòng)物分組及給藥方法

本研究采用昆明系小鼠，體質(zhì)量20g±2g，分為對(duì)照組（灌服生理鹽水）、實(shí)驗(yàn)組（低劑量、中劑量和高劑量）。將植物乳桿菌TD 109制備成菌數(shù)107，108和109m L-1的菌懸液，按1m L（每100 g體質(zhì)量），以表1設(shè)計(jì)方案灌服給各組小鼠，每日1次，灌胃期間自由取食，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.2.2 臟器指數(shù)測(cè)定

在末次灌胃24 h后，稱量各組小鼠體質(zhì)量，然后將小鼠脫頸處死，摘取脾臟、胸腺，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，按如下公式計(jì)算臟器指數(shù)[8]，即

臟器指數(shù)=免疫器官質(zhì)量（m g）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.2.2.3 細(xì)胞因子測(cè)定

于末次灌胃后24 h摘眼球采集全血，將采集的全血放入4℃冰箱靜置過(guò)夜，3 000 r/m in離心3 min，分離血清于離心管中備用。本實(shí)驗(yàn)采用的檢測(cè)方法是雙抗體夾心ABC-ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，繪制標(biāo)注曲線，計(jì)算血清中IL-2，IFN-γ，TNF-α質(zhì)量濃度。

1.2.2.4 M TT活力測(cè)定

將小鼠斷頸處死后，無(wú)菌取脾臟，將脾臟200目篩網(wǎng)研磨后過(guò)濾，用除菌后的Hank's液洗2次，離心10 min（1 000 r/m in）。然后取1m L完全培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮于其中，用臺(tái)酚蘭染色，從而計(jì)數(shù)活細(xì)胞（應(yīng)在95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106m L-1。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL的脾細(xì)胞懸液，每個(gè)樣本設(shè)10個(gè)重復(fù)孔，再加入終質(zhì)量濃度為5μg/m L的ConA溶液 150μL，并用含 10%胎牛血清的RPIM 1640作空白對(duì)照。置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，結(jié)束培養(yǎng)4 h前，每孔加入質(zhì)量濃度為5 m g/m L的M TT 50μL，繼續(xù)孵育4 h，棄掉上清液，每孔加入150μL DM SO，輕微振蕩，在酶標(biāo)儀570 nm讀數(shù)，以空白對(duì)照孔矯正零點(diǎn)，結(jié)果以570 nm處的OD值表示[8]。

1.2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0處理，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，不同分組間比較采用單因素方差分析（one-way-ANOVA）的方法，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 粘附能力測(cè)定

細(xì)胞的培養(yǎng)如圖1和圖2所示。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及飼養(yǎng)方式

不同菌株黏附能力比較：乳桿菌主要在腸黏膜上發(fā)揮其益生功能，所以乳桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附能力是對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)重要的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，粘附能力高的菌株對(duì)免疫作用的發(fā)揮也有著促進(jìn)的效果。由圖3可知，不同乳桿菌對(duì)Caco-2的粘附能力存在顯著差異，四株菌對(duì)細(xì)胞的粘附率分別為14.59%，18.63%，9.66%和3.71%。其中，植物乳桿菌TD 109的粘附率最高，與之前的研究[9-10]相比，具有較高的粘附率，因此選用植物乳桿菌TD 109來(lái)進(jìn)行后續(xù)的研究。圖3中，數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2.2 臟器指數(shù)測(cè)定

胸腺是免疫相關(guān)的中樞器官，直接影響著外周免疫器官的發(fā)育以及細(xì)胞及體液免疫功能[11]；脾臟中有豐富的淋巴細(xì)胞，其臟器指數(shù)也可以在一定程度上反映出機(jī)體免疫能力的強(qiáng)弱，所以選擇對(duì)小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)進(jìn)行測(cè)定。由表2可以看出，與對(duì)照組相比，植物乳桿菌TD 109灌胃后的各組在胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)上均出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說(shuō)明低劑量、中劑量以及高劑量的植物乳桿菌都對(duì)小鼠的免疫力起到提高的作用。低、中、高劑量的胸腺指數(shù)之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），低劑量組的脾臟指數(shù)與高劑量組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.3 細(xì)胞因子測(cè)定

細(xì)胞因子在動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中起著非常重要的作用，對(duì)小鼠的研究表明，乳酸菌可以影響小鼠血液中細(xì)胞因子的含量。對(duì)患有腫瘤疾病的小鼠進(jìn)行干酪乳桿菌飼喂后，其體內(nèi)的IL-12和IFN-γ水平有所增加[12]，還有實(shí)驗(yàn)證明，乳酸菌可以通過(guò)抑制INF-α等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[13-14]。本實(shí)驗(yàn)選用了IL-2、IFN-γ、TN F-α三種細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，以反映機(jī)體的免疫功能。

由表3可知，灌服植物乳桿菌TD 109提高了小鼠體內(nèi)IFN-γ和IL-2的含量，且促進(jìn)作用隨濃度增加而增強(qiáng)，高劑量組與低、中劑量相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但低劑量和中劑量之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TN F-α的含量在乳桿菌灌胃后得到降低，但各劑量間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 M TT活力測(cè)定

M TT是一種測(cè)定細(xì)胞相對(duì)活力的方法，可以用來(lái)間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。表4顯示，植物乳桿菌TD 109可以增強(qiáng)脾細(xì)胞代謝M TT活力，與對(duì)照組比較，菌濃度為107，108和109m L-1的實(shí)驗(yàn)組均顯現(xiàn)了顯著性差異，且增強(qiáng)作用隨多糖濃度的增加而增強(qiáng)，進(jìn)一步反映出該株植物乳桿菌對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。

表3 植物乳桿菌TD109對(duì)IL-2，IFN-γ，TNF-α的影響ng/m L

3 結(jié)論

本研究對(duì)選取的4株乳酸菌進(jìn)行了黏附能力的比較，結(jié)果表明植物乳桿菌TD 109具有較強(qiáng)的黏附能力，可達(dá)到18.63%。在對(duì)小鼠臟器指數(shù)的測(cè)定結(jié)果中，與對(duì)照組相比較，低劑量、中劑量、高劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，小鼠的免疫臟器發(fā)育得到了明顯的促進(jìn)。以上結(jié)果證明，TD 109可以通過(guò)促進(jìn)小鼠胸腺及脾臟等免疫器官的發(fā)育，起到提高免疫功能的作用[15-16]。在細(xì)胞因子方面，小鼠血清中的IL-2和IFN-γ質(zhì)量濃度，經(jīng)過(guò)乳桿菌灌胃處理后都得到了顯著的提高，腫瘤壞死因子TNF-α也出現(xiàn)了顯著的降低，同時(shí)，通過(guò)MTT含量的測(cè)定，進(jìn)一步地證明了此株菌的免疫功能。

表2 植物乳桿菌TD109對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 mg/g

圖2 達(dá)到極化狀態(tài)的Caco-2細(xì)胞（200×）

圖3 不同乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附率

表4 植物乳桿菌TD109對(duì)MTT活力的影響

圖1 Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)

綜上所述，植物乳桿菌TD 109具有一定的免疫增強(qiáng)作用，為對(duì)植物乳桿菌TD 109免疫相關(guān)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。