李明陽，馬春霞，吳翰欣，吳小海，俞建昆

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118；

2.昆明醫(yī)學(xué)大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，云南 昆明 650118

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是常見于我國南方及東南亞地區(qū)的鼻咽部惡性腫瘤，尤其高發(fā)于廣東省[1]。鼻咽癌的發(fā)病與Epstein Barr病毒（Epstein Barr virus，EBV）感染、遺傳因素及環(huán)境因素密切相關(guān)[2-6]。EBV的再激活與NPC的發(fā)展之間存在一定的相關(guān)性。隨著高通量測序技術(shù)及基因芯片技術(shù)的發(fā)展，從不同層次如基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組等方面研究惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后已成為全世界科學(xué)家的首選方法[7-9]?；蛐酒呢暙I(xiàn)者先前已證明低劑量的N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）與12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）和丁酸鈉（SB）具有協(xié)同作用，用于增強(qiáng)攜帶EBV的NPC細(xì)胞中的EBV再激活和基因組不穩(wěn)定性[10]。在此，我們利用生物信息學(xué)方法篩選EBV再激活后NPC細(xì)胞的差異表達(dá)基因（differentiallyexpressed genes，DEGs），為相關(guān)臨床研究提供重要的信息基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞基因表達(dá)譜下載自NCBI的GEO DataSet數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov），編號為GSE38453，該芯片中包含2種鼻咽癌細(xì)胞系NA細(xì)胞NA-P10/TS-MG和NA-P1/mock的表達(dá)譜。NA-P10/TS-MG是指具有10次組合的TPA/SB和MNNG（TS-MG）處理的NA細(xì)胞，通過將這些細(xì)胞與 TPA/SB（10ng/mL和 1.0mmol/L）及 MNNG（0.1 μg/mL）組合周期性溫育來對NA-P10/TSMG細(xì)胞進(jìn)行10次重復(fù)化學(xué)暴露。NA-P1/mock是經(jīng)過1次傳代的模擬處理的NA細(xì)胞。每種細(xì)胞均有2次重復(fù)。

1.2 方法

利用R語言程序包（edgR包）篩選差異表達(dá)基因并繪制基因表達(dá)熱圖（標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置：差異表達(dá)倍數(shù)∣FC∣＞1，F(xiàn)DR＜0.05，P＜0.05）。利用在線分析工具（https://david.ncifcrf.gov/和http://www.string-db.org/）對篩選出的候選基因進(jìn)行GO富集、KEGG通路分析及蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，以確定核心基因。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因分析

EBV經(jīng)過化學(xué)再刺激后，從鼻咽癌細(xì)胞系中共篩選出4496個DEGs，包括1954個上調(diào)基因和2542個下調(diào)基因（P＜0.05）。選取前50個繪制基因表達(dá)熱圖（圖1），并選取前246個DEGs進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 基因表達(dá)熱圖（Top 50）

2.2 GO基因富集分析

GO分析結(jié)果顯示，DEGs在生物過程（biological processes，BP）中顯著富集，包括病毒應(yīng)答、Ⅰ型干擾素信號通路、γ干擾素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑、病毒防御反應(yīng)、膽固醇生物合成過程、氧化還原過程、類異戊二烯生物合成過程、類固醇代謝過程、脂質(zhì)代謝過程和花生四烯酸代謝過程（表1）；在分子功能（molecular function，MF）中，包括絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、蛋白同二聚化活性、醛脫氫酶（NAD）活性、氧結(jié)合、3-氯烯丙基醛脫氫酶活性、血紅素結(jié)合、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、氧化還原酶活性、鐵離子結(jié)合和藥物結(jié)合（表2）；在細(xì)胞組分（cell component，CC）中，包括胞外體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器膜、基底外側(cè)質(zhì)膜、胞外空間、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體、線粒體、頂端質(zhì)膜（表3）。

表1 生物過程分析結(jié)果（Top 10）

表2 分子功能分析結(jié)果（Top 10）

表3 細(xì)胞組分分析結(jié)果（Top 10）

2.3 KEGG通路分析

如表4，KEGG通路分析顯示，DEGs在代謝途徑、抗生素生物合成、萜類骨架生物合成、化學(xué)致癌作用、丙型肝炎、膽汁分泌、細(xì)胞色素P450代謝外源性物質(zhì)、氨基酸生物合成、類固醇生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等信號通路中顯著富集。

2.4 候選基因蛋白產(chǎn)物互相作用分析

在蛋白互作分析網(wǎng)絡(luò)中，MAPK3、IRF7、IRF9、IFI6、TRIM22、IFI27、OAS2、TRIM31、HLA-F和MX1節(jié)點(diǎn)度最高，即為核心基因（圖2）。

圖2 候選基因蛋白產(chǎn)物相互作用

3 討論

EBV是導(dǎo)致鼻咽癌的主要因素，化學(xué)致癌物對其的激活作用可能在NPC的發(fā)展中起重要作用。已證明TPA和SB可以誘導(dǎo)EBV的再激活，從而增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生率[10-11]。此外，聯(lián)合治療時(shí)，低劑量MNNG（0.1 μg/mL）與TPA/SB具有協(xié)同增效作用[12]。由于鼻咽癌高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的居民可能以長期低劑量重復(fù)的方式接觸這些致癌物，我們試圖確定攜帶EBV的鼻咽細(xì)胞暴露于致癌物的后果。

通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)EBV再激活后，宿主細(xì)胞中1954個基因上調(diào)、2542個基因下調(diào)，這些基因主要在代謝途徑、抗生素生物合成、萜類骨架生物合成、化學(xué)致癌作用、丙型肝炎、膽汁分泌、細(xì)胞色素P450代謝外源性物質(zhì)、氨基酸生物合成、類固醇生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等信號通路中顯著富集，為相關(guān)臨床研究提供了重要的信息基礎(chǔ)。