陳 櫞，周 元，尹必輝，李懷亮，侯衛(wèi)曉，周益龍，邵冰峰，張素青，徐愛兵，張一心*

1.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院外科，南通 226300 2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院臨床醫(yī)學(xué)系，南通 226019

肝癌在我國發(fā)病率居惡性腫瘤的第4位，死亡率居第3位[1]，其中原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)占85%～90%以上。南通地區(qū)位于江海平原，是乙型肝炎高發(fā)地區(qū)，大多數(shù)患者就診時(shí)病變已屬中晚期，如何早期監(jiān)測肝癌的發(fā)生成為關(guān)鍵。目前認(rèn)為，致癌基因的激活與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制癌基因的高表達(dá)可以防止正常細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，甚至可使惡性腫瘤細(xì)胞向正常方向逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[2]。Yes-associated protein(YAP)和Forkhead-box P1(FOXP1)是HCC的致癌基因，在HCC組織中二者是否相互作用，值得進(jìn)一步研究。因此，本研究觀察HCC肝癌組織中YAP、FOXP1 mRNA的表達(dá)情況，初步探討二者對(duì)患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2004年1月至2007年12月本院收治并經(jīng)病理組織學(xué)確診的HCC患者的石蠟?zāi)[瘤標(biāo)本共114例，其中男性91例，女性23例，中位年齡49.28歲(年齡范圍21～75歲)。腫瘤TNM分期按WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集患者臨床信息，包括年齡、性別、病理類型、臨床分期等。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何放化療和免疫治療，患者詳細(xì)資料見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 Real-time RT-PCR試劑盒：High Pure RNA Tissue Kit、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler480 SYBR Green Ⅰ Master均購自Roche公司。YAP、FOXP1、GAPDH引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，具體序列如下，YAP引物序列：5′-CTA TTG GTC GTC ATT GTT CTC-3′(正向)，5′-AGT TAG CCC TGC GTA GCC-3′(反向)，F(xiàn)OXP1引物序列：5′-CGG TAC TCA GAC AAA TAC AA-3′(正向)，5′-GTC GGA AGT AAG CAA ACA-3′(反向)，GAPDH引物序列：5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′(正向)，5′-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3′(反向)。

1.3 Real time RT-PCR測定基因表達(dá) HCC及癌旁石蠟組織(paraffin-embedded tissues)中RNA的提?。簩⑾瀴K組織切成6～8 μm切片，至1.5 mL離心管中，加入1 mL二甲苯，混勻，離心2 min。取上清液，加入1 mL無水乙醇，混勻，離心2 min，取上清液。加入150 μL Buffer PKD，重懸沉淀。加入10 μL蛋白酶K，混勻。56℃孵育15 min，20 000×g離心15 min。取上清液，至1.5 mL離心管中。提取方法參照文獻(xiàn)[3-4]。Real time RT-PCR檢測方法參照Roche說明書，構(gòu)建20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，混勻后37℃溫浴5 min。42℃溫浴60 min，70℃溫浴10 min，終止反應(yīng)。構(gòu)建20 μL聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件：94℃ 10 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析結(jié)果，根據(jù)陰性對(duì)照調(diào)整閾值和基線以確定各個(gè)標(biāo)本的Ct值，并根據(jù)熔解曲線確定該Ct值是否有效。2-ΔΔCt值計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[3]，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量定量分析。參照文獻(xiàn)[5]，以癌旁組織作為對(duì)照組進(jìn)行定性分析：若癌組織中表達(dá)量大于癌旁組織則為陽性，癌中表達(dá)量等于或小于癌旁組織則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析YAP、FOXP1 mRNA表達(dá)水平與肝癌患者臨床特征的相關(guān)性，比較癌及癌旁組織中YAP、FOXP1的表達(dá)差異。采用T檢驗(yàn)(Wilcoxon non-parametric signed-rank test)對(duì)組織中YAP、FOXP1 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行組內(nèi)和組間差異分析，采用Pearson分析YAP、FOXP1 mRNA表達(dá)間的相關(guān)性。隨訪患者5年的無病生存期(disease-free survival, DFS)，單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸用于分析患者在各種不同影響因素下的生存差異，單變量回歸分析中的顯著因素進(jìn)一步納入多因素回歸分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 癌及癌旁組織YAP和FOXP1 mRNA的表達(dá)差異 Real time RT-PCR結(jié)果(圖1A)表明：HCC組織FOXP1 mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.62±0.24vs0.28±0.17，P<0.000 1)，HCC組織YAP mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.61±0.29vs0.20±0.12，P<0.000 1)。進(jìn)一步相關(guān)性分析結(jié)果(圖1B)表明：HCC組織YAP、FOXP1 mRNA表達(dá)水平正相關(guān)(r=0.76，P<0.000 1)。

2.2 癌組織YAP、FOXP1 mRNA表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性 結(jié)果(表1)表明：HCC組織YAP、FOXP1 mRNA陽性表達(dá)與患者腫瘤直徑、TNM分期、AFP相關(guān)(P<0.05)。

圖1 癌及癌旁組織YAP、FOXP1 mRNA的表達(dá)

表1 HCC組織YAP、FOXP1 mRNA表達(dá)與肝癌患者臨床特征的相關(guān)性

*P<0.05

2.3 HCC患者DFS影響因素分析 結(jié)果(表2)表明：隨訪5年，單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)DFS生存時(shí)間受患者腫瘤分化程度、TNM分期、肝內(nèi)腫瘤個(gè)數(shù)、AFP、HBV感染、YAP和FOXP1表達(dá)的影響(P<0.05)。

表2 患者隨訪5年DFS的單因素回歸分析

*P<0.05

2.4 Kaplan-Meier生存分析 結(jié)果(圖2)表明：YAP陽性HCC患者DFS生存時(shí)間短于YAP陰性患者(17個(gè)月vs26個(gè)月,P=0.020 7)；FOXP1陽性患者DFS生存時(shí)間短于FOXP1陰性患者(18個(gè)月vs27個(gè)月，P=0.004 2)；YAP、FOXP1共表達(dá)陽性患者DFS生存時(shí)間短于YAP、FOXP1共表達(dá)陰性患者(18個(gè)月vs24個(gè)月，P=0.003 7)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示：YAP、FOXP1陽性表達(dá)影響患者的治療效果，縮短了患者的DFS時(shí)間。

圖2 Kaplan-Meier生存分析HCC患者DFS

A:YAP表達(dá)陰性vsYAP表達(dá)陽性;B:FOXP1表達(dá)陰性vsFOXP1表達(dá)陽性;C:YAP、FOXP1共表達(dá)陰性vsYAP、FOXP1共表達(dá)陽性

3 討 論

HCC是目前我國較為常見的惡性腫瘤，且病死率居前3位。HCC治療方式首選手術(shù)治療，但術(shù)后5年腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%～70%，這與術(shù)前可能已存在微小播散灶或多中心發(fā)生有關(guān)，且合并有HBV感染及病毒復(fù)制活躍的HCC患者預(yù)后較無罹患肝炎的患者差[1]。南開大學(xué)的學(xué)者提出HBV相關(guān)蛋白X蛋白通過激活YAP/FOXA1信號(hào)通路影響HBV病毒復(fù)制，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[2]。其他研究人員研究了罹患HBV的HCC樣本后認(rèn)為FOXP1可能參與HBV相關(guān)肝硬化的癌變過程[6]。而FOXP1是FOX家族轉(zhuǎn)錄因子成員之一，參與細(xì)胞增殖、分化和代謝過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在HCC中FOXP1高表達(dá)影響HCC患者預(yù)后[5]，對(duì)HCC細(xì)胞增殖和遷移能力有影響[7]。利用轉(zhuǎn)染技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)抑制FOXP1表達(dá)，可抑制HCC細(xì)胞增殖，導(dǎo)致G1/S期受阻，有絲分裂時(shí)間延長，激活型Rb和磷酸化Rb的表達(dá)及E2F1表達(dá)在24 h時(shí)明顯降低[8]。

Hippo-YAP通路是控制腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。去磷酸化的YAP能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，抑制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖。Mizuno等[9]發(fā)現(xiàn)下調(diào)Hippo-YAP、FOXM1 mRNA的表達(dá)，可抑制惡性間皮瘤腫瘤細(xì)胞的生長和促進(jìn)凋亡。YAP通過轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子TEAD(transcription enhancer and activator domain)直接影響FOXM1的表達(dá)。Weiler等[10]對(duì)人肝癌細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因小鼠和肝癌組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)YAP與FOXM 1協(xié)同作用導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定。除肝癌外，Rizvi等[11]發(fā)現(xiàn)在膽管癌細(xì)胞中FOXM1的表達(dá)依賴于YAP，將沉默YAP基因?qū)е翭OXM1蛋白表達(dá)水平下降，能誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞的死亡。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)FOXM1和YAP在卵巢癌中的表達(dá)也有相關(guān)性[12]。YAP不僅與FOXM1有關(guān)，還與FOX家族的其他成員有關(guān)。有研究[13]表明在肝癌細(xì)胞中RANT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2與YAP之間密切相關(guān)，其相互作用是通過依賴FOXA1調(diào)控的抑制腫瘤抑制因子lncRNA，從而達(dá)到致癌作用。Hippo通路通過抑制YAP-FOXO1的功能而對(duì)心肌細(xì)胞的存活產(chǎn)生抑制作用[14]。同樣，YAP不僅在HCC中高表達(dá)，也在膽管癌中高表達(dá)，敲除SGC-7901和MGC-803胃癌細(xì)胞中FOXA1發(fā)現(xiàn)YAP的表達(dá)量下降，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。

不僅在腫瘤中YAP與FOX家族基因關(guān)系密切，在體細(xì)胞中二者間也有相關(guān)性。Yuan等[16]體外研究胰島素β細(xì)胞發(fā)現(xiàn)YAP的過度表達(dá)能顯著誘導(dǎo)人胰島β細(xì)胞增殖，且能誘導(dǎo)胰島素分泌β細(xì)胞中的抗凋亡作用所需要的Trx 1/2生成，具有較強(qiáng)的促增殖和抗凋亡功能，且發(fā)現(xiàn)FOXM 1在YAP過表達(dá)時(shí)被上調(diào)，是YAP依賴的β細(xì)胞增殖所必需的。YAP過表達(dá)可保護(hù)β細(xì)胞免受多種導(dǎo)致糖尿病條件所誘導(dǎo)的凋亡，可用于恢復(fù)糖尿病患者的外分泌功能。在心肌細(xì)胞中下調(diào)miR-206的表達(dá)水平抑制誘導(dǎo)心肌肥大和存活的YAP的表達(dá)水平，同時(shí)FOXP1過表達(dá)又影響miR-206的表達(dá)[17]。由此可見，在心肌細(xì)胞中FOXP1和YAP間通過miR-206相互作用。Hippo-YAP-FOXA2信號(hào)通路在肺外周成熟和表面活性物質(zhì)穩(wěn)態(tài)中也起著重要作用[18]。

RT-PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床檢測多種惡性腫瘤石蠟樣本中相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括肺癌[19]、浸潤性膀胱癌[20]、胃癌[21]、肝癌[22]等惡性腫瘤。國外研究[3-4]表明從石蠟組織中提取mRNA與冰凍組織中提取mRNA幾乎一致，且與免疫組化(IHC)測定結(jié)果約90%的一致性。本課題組前期研究了FOX家族的FOXP1[6]在肝癌組織中表達(dá)情況，采用RT-PCR和免疫組化技術(shù)證實(shí)了FOXP1在癌組織中的高表達(dá)，且癌組織高于癌旁組織，其高表達(dá)影響HCC預(yù)后，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析FOXP1與Hippo-YAP信號(hào)通路之間的關(guān)系。本研究在之前研究的基礎(chǔ)上，回顧性分析FOXP1與YAP表達(dá)水平相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)癌組織YAP和FOXP1 mRNA表達(dá)均大于癌旁組織，YAP與FOXP1的mRNA與腫瘤直徑、TNM分期、AFP水平有關(guān)，且二者表達(dá)正相關(guān)。單因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的DFS與患者腫瘤的分化程度、TNM分期、肝內(nèi)腫瘤個(gè)數(shù)、AFP水平、HBV感染、YAP、FOXP1高表達(dá)有關(guān)；進(jìn)一步多因素分析發(fā)現(xiàn)患者肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)與患者HBV感染和YAP、FOXP1高表達(dá)有關(guān)，YAP、FOXP1共同影響HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)。

隨著我國經(jīng)濟(jì)及醫(yī)學(xué)的發(fā)展，多種抗癌靶向藥物不再是遙不可及，給術(shù)后復(fù)發(fā)患者的治療帶來了多種選擇的機(jī)會(huì)，有望延長肝癌患者總生存率(overall survival, OS)。越來越多的癌基因及抑癌基因的發(fā)現(xiàn)表明癌癥相關(guān)基因不再是孤立的影響因素，而是在相互作用下共同發(fā)揮作用，給臨床研究帶來了新的挑戰(zhàn)。