彭 睿，黃曉勇，蔡加彬，柯愛武，施國(guó)明，柏斗勝,3*

1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410000 2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032 3.江蘇省蘇北人民醫(yī)院，揚(yáng)州 225001

肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的腫瘤，在原發(fā)性肝臟腫瘤發(fā)病率中排名第二[1]。近年來，我國(guó)ICC發(fā)病率逐年升高，由于ICC起病隱匿，侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，且缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物，除早期手術(shù)外其他治療效果有限，患者中位生存期時(shí)間短且易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[2-3]。因此，探討ICC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制，篩查新的關(guān)鍵分子，對(duì)于ICC腫瘤治療及預(yù)后改善有重要臨床意義。

TRIM44是Triple motif(TRIM)三基序蛋白家族成員之一，該家族成員結(jié)構(gòu)各異、功能不同，但主要為E3泛素連接酶[4]。TRIM家族成員功能涉及細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞免疫等[5-6]。研究表明：TRIM44在肺癌[7]、前列腺癌[8]、甲狀腺癌[9]、食管癌[10]、肝癌[11]中高表達(dá)且表現(xiàn)為促癌作用，但是在ICC中的表達(dá)及臨床意義不明。

基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，又稱為明膠酶B，其大多數(shù)時(shí)候是無活性的前體蛋白，在細(xì)胞外蛋白酶修飾后才被活化。其作用主要是降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白[12]，參與許多生理過程，如胚胎發(fā)育、組織分化等，也與諸多疾病密切相關(guān)，包括炎癥和腫瘤[13]。在腫瘤中，MMP9降解基底膜和細(xì)胞外的Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白，直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞突破基底膜，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[14]，并且在肝癌和胰腺癌中可作為預(yù)后指標(biāo)[15]。我們的前期研究[16]發(fā)現(xiàn)TRIM44可通過ERK1/2信號(hào)途徑促進(jìn)ICC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。而ERK1/2信號(hào)在MMP9表達(dá)中發(fā)揮重要作用[17-18]。因此，本研究擬探討TRIM44和MMP9在ICC中的表達(dá)及其相關(guān)性，并分析兩者在ICC患者預(yù)后中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 組織來源及患者資料 2002～2009年復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的87例ICC患者腫瘤及癌旁組織入選本研究。所有患者都進(jìn)行了完整的手術(shù)切除，并有明確的病理診斷和5年隨訪資料。本研究獲得了復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。所有患者均知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)染色測(cè)定蛋白表達(dá) 87例患者的腫瘤組織芯片由上海芯超公司制作，取芯片60℃高溫烘烤1 h，二甲苯脫蠟2次，每次10 min，分別用95%、85%、75%無水乙醇梯度水化，每步驟5 min，然后用PBS清洗，切片滴加3%過氧化氫孵育30 min；之后將芯片放入煮沸的EDTA(pH=8.0)的抗原修復(fù)液中20 min，然后用5%的胎牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，分別滴加一抗TRIM44(Proteintech，11511-1-AP，1∶400)，MMP9(Abcam，ab76003，1∶2 000)，4℃孵育12 h；第2天洗去一抗并使用屬兔通用二抗室溫孵育1 h，DAB顯色；鏡檢觀察至深棕色不變后放入清水終止反應(yīng)，蘇木精染核1 min，1%鹽酸乙醇分色，反藍(lán)；最后無水乙醇脫水，二甲苯透明風(fēng)干，中性樹膠封片拍照。TRIM44和MMP9陽性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[16,19-20]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件，組間資料用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法分析生存曲線，單因素和多因素分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 ICC腫瘤及癌旁組織TRIM44、MMP9蛋白的表達(dá) 結(jié)果表明：TRIM44蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖1A)，TRIM44在ICC腫瘤中表達(dá)水平較癌旁組織更高(P<0.05)，且TRIM44在癌組織中表達(dá)異質(zhì)性明顯；MMP9蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在間質(zhì)中少量表達(dá)(圖1B)，癌組織明顯高于癌旁組織(P<0.05)，且在不同癌組織中表達(dá)差異明顯。

圖1 ICC及癌旁組織TRIM44、MMP9蛋白的表達(dá)

A：TRIM44在ICC組織中的表達(dá)；B：MMP9在ICC組織中的表達(dá).Original magnification：×40(原圖)，×200(放大)

2.2 ICC組織TRIM44、MMP9蛋白表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)果(圖2)表明：ICC組織TRIM44、MMP9蛋白表達(dá)存在異質(zhì)性；87例患者ICC組織中TRIM44、MMP9蛋白表達(dá)的陽性強(qiáng)度正相關(guān)(r2=0.412 6，P<0.001)。

圖2 ICC 組織TRIM44、MMP9蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.3 ICC組織TRIM44、MMP9蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 結(jié)果顯示：TRIM44表達(dá)高的ICC患者(n=36)生存率明顯低于TRIM44低表達(dá)患者(n=51)，復(fù)發(fā)率則高于低表達(dá)組(圖3A、3B，P=0.017、P=0.001)。與此同時(shí)，MMP9表達(dá)高的患者(n=40)生存率更低，復(fù)發(fā)率更高(圖3C、3D，P<0.001)。將兩個(gè)指標(biāo)合并分析(圖3E、3F，P<0.001)，將患者分為3組，第1組為兩者均高表達(dá)組(n=19)，第2組為兩者均低表達(dá)組(n=30)，剩余為第3組(n=38)。結(jié)果顯示兩者均低表達(dá)組的總體生存率高于其他兩組(P<0.001)，而第3組和第1組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.099)。在累計(jì)復(fù)發(fā)率方面，兩者均低表達(dá)組患者的復(fù)發(fā)率明顯低于其余兩組(P<0.001)，兩者均高表達(dá)組的復(fù)發(fā)率較第3組更高(P=0.026)。

圖3 ICC組織TRIM44、MMP9蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性分析

A：TRIM44表達(dá)與ICC患者總體生存率的關(guān)系，高表達(dá)組患者預(yù)后差(P=0.017)；B：TRIM44表達(dá)與ICC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，高表達(dá)組患者復(fù)發(fā)率高(P=0.001)；C：MMP9高表達(dá)的患者生存率更低(P<0.001)；D：MMP9高表達(dá)患者復(fù)發(fā)率更高(P<0.001)；E：兩者均低表達(dá)患者生存率更高；F：兩者均高表達(dá)患者復(fù)發(fā)率更高

2.4 TRIM44、MMP-9表達(dá)與ICC患者臨床病理因素相關(guān)性分析 結(jié)果(表1)表明：TRIM44表達(dá)高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.014)，MMP9的表達(dá)與腫瘤大小(P=0.007)、AFP水平(P=0.02)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.012)。

2.5 ICC患者預(yù)后影響因素分析 結(jié)果(表2)表明：腫瘤大小(直徑<5 cmvs≥ 5 cm)、腫瘤個(gè)數(shù)(單個(gè)vs多個(gè))、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無vs有)、癌栓(無vs有)、肝硬化(無vs有)、腫瘤分化(低vs高)、TRIM44表達(dá)(低vs高)、MMP9表達(dá)(低vs高)、兩者共同表達(dá)(1組vs2組和3組)是影響ICC患者總體生存率和復(fù)發(fā)率的因素。多因素分析結(jié)果顯示TRIM44蛋白表達(dá)、MMP9蛋白表達(dá)及兩者共同表達(dá)是影響ICC患者累計(jì)復(fù)發(fā)率的獨(dú)立預(yù)后因素。

表1 TRIM44、MMP9蛋白表達(dá)與ICC患者臨床病理因素相關(guān)性分析

aFisher精確檢驗(yàn)；AFP：甲胎蛋白；HBsAg：乙肝表面抗原；CA19-9：糖類抗原19-9.*P<0.05

3 討 論

近年來ICC的發(fā)病率日漸升高，由于該腫瘤異質(zhì)性強(qiáng)，早期診斷困難，手術(shù)外有效的治療手段較少。針對(duì)ICC的診斷和治療研究一直是臨床上的熱點(diǎn)[21-22]。本研究探討TRIM44和MMP9蛋白在ICC腫瘤中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TRIM44和MMP9在腫瘤組織的表達(dá)普遍高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，并且兩者表達(dá)正相關(guān)，進(jìn)一步研究結(jié)果顯示兩者高表達(dá)均與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TRIM44和MMP9同時(shí)高表達(dá)的患者生存率更低，復(fù)發(fā)率更高，兩者共同低表達(dá)的患者生存率較高，總體復(fù)發(fā)率更低，并且為獨(dú)立的復(fù)發(fā)因素。

TRIM44作為TRIM家族成員，是一種特殊的泛素化酶，涉及多種病理生理過程[23]。既往研究顯示TRIM44在腫瘤常呈過表達(dá)情況，并且可通過AKT-NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[7,11,24]。我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)TRIM44也可以影響ERK1/2信號(hào)通路[16]。另外我們前期報(bào)道UHRF2在ICC中的表達(dá)及作用，盡管該分子也能作為潛在的ICC診斷標(biāo)志物，但本研究考慮MMP9和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而前期研究也認(rèn)為TRIM44和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，本研究進(jìn)一步分析了TRIM44、MMP9表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示TRIM44和MMP9表達(dá)正相關(guān)。結(jié)果提示TRIM44可能和MMP9表達(dá)有著密切關(guān)系，未來研究擬在TRIM44干擾和過表達(dá)的細(xì)胞株內(nèi)驗(yàn)證MMP9的表達(dá)水平，并且通過免疫共沉淀法檢測(cè)兩者是否有直接相互作用關(guān)系。

綜上所述，TRIM44和MMP9在ICC腫瘤中的表達(dá)上調(diào)顯示其與ICC腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，聯(lián)合兩者表達(dá)情況可為ICC患者復(fù)發(fā)和預(yù)后評(píng)估提供參考。