汪德培，陳建鋒，李 歡，趙 鋼，何曉東，褚家如

(1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 精密機(jī)械與精密儀器系，安徽 合肥 230027；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院，安徽 合肥 230001)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)是指從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散進(jìn)入外周循環(huán)血液系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞，CTCs的檢測對于癌癥的診斷和治療具有重要意義[1]，但由于其數(shù)量極其稀少，10 mL血液中CTCs的數(shù)目僅為1～10個(gè)，因此在臨床上必須從腫瘤血液樣品中分選出CTCs。目前，CTCs分選方法主要有基于物理性質(zhì)和基于化學(xué)性質(zhì)兩大類[2]，其中，基于物理性質(zhì)的過濾法利用癌細(xì)胞與正常體細(xì)胞物理大小和變形能力的區(qū)別來實(shí)現(xiàn)分選，這種方法因具有操作簡單、捕獲效率高和成本低等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。

目前，很多物理過濾法能夠?qū)崿F(xiàn)CTCs的高效捕獲[3-5]，但卻無法將捕獲到的CTCs從過濾芯片中釋放出來，以用于進(jìn)一步研究，或者釋放流程復(fù)雜、成本高，這主要是由于CTCs細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)與過濾芯片材料表面產(chǎn)生了較強(qiáng)的粘附力。影響這種粘附力的因素主要有材料的表面形貌、親疏水性、表面基團(tuán)及電負(fù)性等[6]。本文使用的氮化硅過濾膜與CTCs之間也存在這種粘附力，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞難以取出，且污染過濾膜。

Y. J. Kim[7]等通過在過濾膜表面涂覆poly(ethylene glycol) (PEG)，大大提高了過濾膜表面的親水性，從而減弱了細(xì)胞與過濾膜之間的粘附力，提高了癌細(xì)胞釋放效率。Zheng A.[8]等通過在過濾膜表面涂覆一層熱敏性水凝膠poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)，其最低臨界相變溫度為32 ℃，當(dāng)環(huán)境溫度高于此溫度時(shí)，過濾膜表面疏水，易于粘附癌細(xì)胞；若低于此溫度，水凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致過濾膜表面由疏水轉(zhuǎn)為親水，從而減弱了癌細(xì)胞與表面的粘附力，提高了釋放效率。目前，這些釋放方法工藝流程復(fù)雜、操作繁瑣、成本相對較高，且不通用。由于本文使用的是超薄氮化硅柵形孔過濾膜，材料特殊且強(qiáng)度較弱，上述方法均不適用。

本文利用微納加工技術(shù)加工出柵形孔氮化硅過濾膜，并用聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片和亞克力板封裝成過濾裝置，利用物理過濾實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的高效捕獲。通過在過濾樣品和反向沖擊液中加入適量濃度的抗凝劑肝素，大大降低了癌細(xì)胞與過濾膜之間的粘附力，顯著提高了癌細(xì)胞從過濾膜上的釋放效率，而且釋放出來的癌細(xì)胞具有活性。這樣既保證了釋放出的癌細(xì)胞可用于進(jìn)一步研究，又能滿足了過濾膜可重復(fù)利用的要求。

1 過濾裝置的設(shè)計(jì)與加工

1.1 過濾膜的設(shè)計(jì)與加工

本文在前期研究中[9]，設(shè)計(jì)了一種柵形孔型結(jié)構(gòu)，經(jīng)過計(jì)算分析可知，在孔隙率和壓差相同的情況下，柵形孔的通量是圓形孔的接近2倍。而高通量是臨床上分選CTCs的一個(gè)重要指標(biāo)，因此柵形孔結(jié)構(gòu)具有明顯優(yōu)勢。

在此基礎(chǔ)上，本文采用如圖1所示的微納加工工藝來加工過濾膜。硅片經(jīng)過化學(xué)氣相沉積、光刻、反應(yīng)離子刻蝕、深硅刻蝕和濕法刻蝕等流程形成柵形孔過濾膜。過濾膜的材料為氮化硅，它是微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)中的一種重要材料，具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性、硬度和光學(xué)特性[10-11]。

圖1 過濾膜工藝流程圖

加工完畢的過濾膜如圖2所示。尺寸為20 mm×20 mm，中間柵形孔區(qū)域尺寸為6 mm×6 mm，厚度為500 nm，柵形孔的長為100 μm，寬度有5、6、7和8 μm等4種。

圖2 柵形孔氮化硅過濾膜

1.2 微流控芯片的封裝

本文采用購買自道康寧公司、型號為DC184的聚二甲基硅氧烷(PDMS)來加工微流道。PDMS是一種常見的熱塑性彈性體,其具有如下優(yōu)點(diǎn)：1)穩(wěn)定的物理和化學(xué)性質(zhì)，良好的力學(xué)性能，易于加工，可多次使用；2)良好的光學(xué)性能，透光性好，可實(shí)時(shí)觀察；3)生物兼容性好，可用于細(xì)胞培養(yǎng)。

微流道的加工采用常用的復(fù)制壓模法，具體流程如下：1)將PDMS和固化劑按10∶1的質(zhì)量比配制成預(yù)聚物，并攪拌均勻；2)利用真空干燥箱除去氣泡；3)將預(yù)聚物澆鑄到已加工好的模具上，在65 ℃熱板上加熱2 h；4)將固化好的PDMS芯片揭下，即可形成一個(gè)與模具圖案相反的流道腔體，將氮化硅過濾膜嵌入PDMS芯片中的腔體中，上下PDMS通過自然粘附力實(shí)現(xiàn)初步密封，然后利用上下亞克力板通過銅柱固定，保證過濾裝置的密封性。裝配好的過濾裝置如圖3所示。

與≥18歲~30歲者比較,p<0.05;與31歲~40歲者比較,p<0.05;與>41歲~50歲者比較,p<0.05;與>50歲者比較,p<0.05;與小學(xué)及以下文化程度比較,p<0.05;與無獻(xiàn)血史者比較,p<0.05;3討論

圖3 過濾裝置

2 癌細(xì)胞的捕獲與釋放

2.1 試驗(yàn)樣品、參數(shù)和方法

本文采用MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞來進(jìn)行試驗(yàn)。首先通過胰蛋白酶消化培養(yǎng)皿中的癌細(xì)胞，使其懸??；細(xì)胞懸浮液經(jīng)離心后，吸走上層液體，加入適量培養(yǎng)基于細(xì)胞沉淀物中形成細(xì)胞懸浮液；吸取1 μL懸浮液于載玻片上并用熒光顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度約為1 500～2 000個(gè)/μL；取2 μL細(xì)胞懸浮液于2 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，即形成過濾樣品。

本文在前期研究和試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇柵形孔寬度為7 μm的過濾膜，流速為0.2 mL/min來進(jìn)行過濾試驗(yàn)。過濾時(shí)通過注射泵推動(dòng)注射器完成，每次先過濾2 mL混合均勻的癌細(xì)胞懸浮液樣品，然后再用1 mL PBS進(jìn)行過濾清洗，結(jié)束后，將過濾膜取出放在倒置熒光顯微鏡下觀察。反向沖擊釋放癌細(xì)胞時(shí)，直接將過濾裝置倒置，從反方向用2 mL PBS沖擊，用培養(yǎng)皿收集沖擊出來的癌細(xì)胞。

2.2 癌細(xì)胞的捕獲與反向沖擊釋放

在上述試驗(yàn)參數(shù)和方法下進(jìn)行癌細(xì)胞的過濾試驗(yàn)，過濾膜捕獲了癌細(xì)胞后的熒光視場圖如圖4a所示；過濾膜在經(jīng)過簡單的反向沖擊釋放后的熒光視場圖如圖4b。

圖4 釋放前、后過濾膜上的癌細(xì)胞熒光視場圖

2.3 捕獲與釋放結(jié)果分析

經(jīng)過多次反復(fù)試驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)過濾樣品中和過濾膜上捕獲的癌細(xì)胞，計(jì)算得柵形孔氮化硅過濾膜的捕獲效率能達(dá)到85%。

對比圖4a和圖4b可以發(fā)現(xiàn)，將捕獲了大量癌細(xì)胞的過濾膜利用PBS進(jìn)行簡單的反向沖擊后，仍有大量癌細(xì)胞殘留在過濾膜上，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，釋放效率只有約35%，大量殘留的癌細(xì)胞會(huì)堵塞過濾膜上的柵形孔，導(dǎo)致過濾膜無法重復(fù)利用。

較低的釋放效率主要是由于癌細(xì)胞細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)與氮化硅過濾膜之間的粘附力導(dǎo)致的。研究表明，這種粘附力主要受如下因素影響。

1)材料表面的親疏水性。一般細(xì)胞膜具有一定的親水性，親水性的材料表面更易與細(xì)胞產(chǎn)生粘附，但親水性極強(qiáng)的材料表面反而不易與細(xì)胞產(chǎn)生粘附。

2)材料表面的電負(fù)性。一般情況下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜表面帶有一定的負(fù)電荷。一般認(rèn)為，帶正電荷的材料表面由于靜電吸附易產(chǎn)生粘附，帶負(fù)電荷的材料表面由于靜電排斥而不易產(chǎn)生粘附。

因此，要提高被捕獲癌細(xì)胞的釋放效率，應(yīng)降低癌細(xì)胞與過濾膜之間的粘附力。其可以通過采用特定親疏水性的材料、使材料表面帶負(fù)電、使材料表面盡量光滑等途徑來實(shí)現(xiàn)。

3 肝素對癌細(xì)胞釋放效率的影響

3.1 試驗(yàn)材料與方法

肝素是一種常用的抗凝劑，是由2種多糖交替連接而成的多聚體，具有帶強(qiáng)負(fù)電荷的理化特性，能干擾血凝過程的許多環(huán)節(jié)，在體內(nèi)外都有抗凝血作用。研究發(fā)現(xiàn)，肝素能在一定程度上抑制細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，從而降低細(xì)胞的粘附力[12]。

過濾前，將過濾膜在肝素溶液中浸泡2 h，過濾樣品為加入癌細(xì)胞和一定濃度的肝素溶液的PBS；試驗(yàn)時(shí)，首先過濾2 mL過濾樣品，再用1 mL PBS沖擊；釋放時(shí)，將過濾裝置倒置，用肝素濃度相等的2 mL PBS反向沖擊。

3.2 肝素對癌細(xì)胞釋放效率的影響

本文在過濾樣品及反向沖擊液中加入等量相同濃度的肝素，在過濾和釋放后，分別用顯微鏡進(jìn)行觀察，效果如圖5所示。

圖5 釋放前、后過濾膜上的癌細(xì)胞明場圖

對比圖5a和圖5b發(fā)現(xiàn)，通過加入肝素，釋放效率明顯提升，釋放后過濾膜上殘余的癌細(xì)胞很少，可重復(fù)使用。

本文繼續(xù)研究了不同肝素濃度對癌細(xì)胞釋放效率的影響，分別用10、20、30、40 和50 μg/mL等5種濃度的肝素進(jìn)行過濾和釋放，各種肝素濃度下的釋放效率如圖6所示。

圖6 肝素濃度對癌細(xì)胞釋放效率的影響

由圖6可知，未使用肝素時(shí)，癌細(xì)胞的釋放效率約為30%；使用了肝素后，釋放效率均在80%以上，釋放效率大大提高，并且當(dāng)肝素濃度為30 μg/mL時(shí)，釋放效率最高，達(dá)到90%以上。

因此，通過加入肝素，可以降低癌細(xì)胞與氮化硅過濾膜表面之間的粘附力，提高癌細(xì)胞釋放效率和過濾膜可重復(fù)利用性，并且在肝素濃度為30 μg/mL時(shí)效果最佳。

3.3 肝素對癌細(xì)胞活性的影響

通過在過濾樣品和反向沖擊液中加入適量濃度的肝素，實(shí)現(xiàn)了被捕獲癌細(xì)胞的高效釋放，但應(yīng)保證釋放出來的癌細(xì)胞具有活性，可用于后續(xù)的試驗(yàn)研究。

本文通過離心管收集反向沖擊釋放出來的癌細(xì)胞，采用3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后，吸去上層清液，加入培養(yǎng)基后利用LIVE/DEAD染色試劑染色30 min，然后在熒光顯微鏡下觀察，效果如圖7所示。

圖7 肝素對癌細(xì)胞活性的影響

圖7中箭頭所指向的熒光為死細(xì)胞，其他熒光為活細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計(jì)多個(gè)視野中的死、活癌細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算得癌細(xì)胞的存活率為98%，說明在樣品中加入肝素對癌細(xì)胞的活性幾乎沒有影響。

4 結(jié)語

本文利用微納加工技術(shù)，加工出了柵形孔氮化硅過濾膜，實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的高效捕獲。為了進(jìn)一步將捕獲的癌細(xì)胞取出用于后續(xù)試驗(yàn)，在分析了癌細(xì)胞與過濾膜之間粘附現(xiàn)象的影響因素之后，通過在過濾樣品和反向沖擊液中加入肝素，明顯降低了癌細(xì)胞與過濾膜之間的粘附力，顯著提高了癌細(xì)胞的釋放效率和過濾膜的可重復(fù)利用性；同時(shí)釋放出來的癌細(xì)胞具有活性。該方法具有操作方便、成本低和通用性強(qiáng)等特點(diǎn)，在臨床上具有潛在應(yīng)用價(jià)值。