陸夢(mèng)茹 朱祖福 張慧萍 孔玉 高志強(qiáng) 楊江勝 陸強(qiáng)彬 柏燕燕 周國(guó)慶 沈麗萍

腦出血是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，占全部腦卒中的20%～30%，急性期病死率為30%～40%，發(fā)生的原因主要與腦血管的病變有關(guān)[1]。腦出血在我國(guó)的發(fā)病率逐年上升，其具有較大的傷殘率，已嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。因此，深入研究腦出血的發(fā)病機(jī)制以及研究腦出血的新治療靶點(diǎn)具有重要的臨床價(jià)值和科學(xué)意義。對(duì)于腦出血的機(jī)制研究，多數(shù)研究都是關(guān)注血管內(nèi)皮等細(xì)胞，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的研究較少且研究較淺。目前有少量研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的自噬反應(yīng)對(duì)腦出血后的炎癥損傷起著非常重要的作用[2]。適當(dāng)激活小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)可促進(jìn)腦損傷的自動(dòng)修復(fù)，但小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化時(shí)將可能加重?fù)p傷[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的發(fā)生與腦出血炎癥損傷息息相關(guān)。有少量研究表明，TLR4相關(guān)信號(hào)通路即TLR4/ MyD88/NF-κB 信號(hào)通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞自噬、炎癥損傷等多個(gè)方面[4-6]。但關(guān)于TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬在腦出血炎癥損傷中的作用的研究較少。因此，本研究將選取C57BL/6J小鼠作為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬與腦出血后炎癥損傷的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

C57BL/6J小鼠、TLR4腺病毒抑制C57BL/6小鼠購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；二抗購(gòu)自碧云天公司；TNF-α，IL-1β，IL-6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自坦克拉公司；質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染配套試劑均購(gòu)自廣州RiboBio公司。TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))；7300型實(shí)時(shí)熒光定量PC電子天平R儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；基礎(chǔ)電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；EL204- (上海特勒-托多利多儀器有限公司)；凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 建立腦出血小鼠模型

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：野生型C57BL/6小鼠。造模方法：用4%水合氯醛麻醉小鼠，之后固定于小鼠腦立體定位儀上；選擇定位坐標(biāo)為前囟向前0.2 mm，旁開(kāi)2.3 mm，深3.5 mm;將采集小鼠靜脈血破碎液30 μL，立即用注射泵以2 μL/min速率將自體血注射入定位位點(diǎn)，注射5 μL后暫停7 min，然后再次以2 μL/min速率將剩余25 μL血液注射完畢，之后停留10 min以防止血液回流;當(dāng)拔出針后用骨蠟對(duì)小鼠頭骨進(jìn)行封閉，縫合皮膚，待小鼠恢復(fù)意識(shí)后繼續(xù)正常飼養(yǎng);手術(shù)時(shí)保證小鼠體溫維持在(37±0.5)℃左右。

1.3 動(dòng)物分組與給藥

A組(空白對(duì)照組)：野生型C57BL/6小鼠；B組(自噬抑制劑對(duì)照組)：野生型C57BL/6小鼠+自噬抑制劑(3-MA)；C組(假手術(shù)組1)：野生型C57BL/6小鼠+假手術(shù)+自噬抑制劑(3-MA)；D組(造模組1)：野生型C57BL/6小鼠+造模+自噬抑制劑(3-MA)；E組(假手術(shù)組2)：野生型C57BL/6小鼠+假手術(shù)+ TLR4腺病毒抑制+自噬抑制劑(3-MA)；F組(造模組2)：野生型C57BL/6小鼠+造模+ TLR4腺病毒抑制+自噬抑制劑(3-MA)。每組各10只小鼠，首先E和F組按照1.2步驟進(jìn)行手術(shù)造模；C組和D組進(jìn)行假手術(shù)；接著E組和F組經(jīng)尾靜脈間隔24 h注射腺病毒載體pAdeno-X-siFas1+siTLR4溶液，108pfu/只，其余組尾靜脈注射生理鹽水(NS)；最后B，C，D和F組尾靜脈注射0.1 mol/L的自噬抑制劑(3-MA)；24 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉并處死，取小鼠腦組織。

1.4 腦組織含水量(water content of brain，BWC)和神經(jīng)功能障礙評(píng)分(neurologic deficit score，NDS)

各組小鼠處死后分別取各組約100 mg的腦組織，用電子天平稱取濕重，記錄數(shù)據(jù)；再放入100 ℃的電熱恒溫箱內(nèi)進(jìn)行48 h烘烤，重復(fù)測(cè)定至恒重；計(jì)算腦組織含水量，即BWC(%)=[(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重]×100%。神經(jīng)功能障礙評(píng)分： 神經(jīng)功能障礙評(píng)分(NDS)按 Garcia 法進(jìn)行，評(píng)分的分?jǐn)?shù)越低，代表神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.5 Western Blot檢測(cè)LC3-II/I比值，TLR4，MyD88，TRIF和NF-κB蛋白表達(dá)水平[7]

常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)方法測(cè)定蛋白質(zhì)水平后進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣20 ug，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上后3%的脫脂奶封閉2 h，分別孵育LC3，TLR4，MyD88，TRIF和NF-κB(目的蛋白)和GAPDH(內(nèi)參蛋白)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，孵育二抗后顯影。采用Quantityone軟件對(duì)條帶亮度進(jìn)行分析。

1.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平[8]

取各組血漿，離心，取上清液用于指標(biāo)測(cè)定，采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BWC和NDS

與C組比較，E組BWC和NDS下降(P<0.05)；與D組比較，F(xiàn)組BWC和NDS下降(P<0.05)(圖1)。

圖1 BWC和NDS 與C組比較,*P<0.05;與D組比較,#P<0.05

2.2 Western Blot檢測(cè)LC3-II/I比值，TLR4，MyD88和NF-κB p65蛋白水平

A，B，C和D組TLR4，MyD88和NF-κB p65蛋白水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；與C組比較，E組TLR4，MyD88，NF-κB p65水平、LC3-II/I比值下降(P<0.05)；與D組比較，F(xiàn)組TLR4，MyD88，NF-κB p65水平、LC3-II/I比值下降(P<0.05)。與A組比較，B，C和D組LC3-II/I比值下降(P<0.05)(圖2)。

2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平

與A組比較，B，C和D組TNF-α，IL-1β，IL-6水平下降(P<0.05)；與C組比較，E組TNF-α，IL-1β，IL-6水平下降(P<0.05)；與D組比較，F(xiàn)組TNF-α，IL-1β，IL-6水平下降(P<0.05)(圖3)。

圖2 Western Blot檢測(cè)各組LC3-II/I比值,TLR4,MyD88和NF-κB p65蛋白水平 與C組比較,*P<0.05;與D組比較,#P<0.05;與A組比較,&P<0.05

3 討 論

腦出血在我國(guó)的發(fā)病率逐年上升，其具有較大的傷殘率，已嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。因此，深入研究腦出血的發(fā)病機(jī)制以及研究腦出血的新治療靶點(diǎn)具有重要的臨床價(jià)值和科學(xué)意義[7-8]。對(duì)于腦出血的機(jī)制研究，目前有少量研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的自噬反應(yīng)對(duì)腦出血后的炎癥損傷起著非常重要的作用[9]。適當(dāng)激活小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)可促進(jìn)腦損傷的自動(dòng)修復(fù)，但小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化時(shí)將可能加重?fù)p傷。小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的發(fā)生與腦出血炎癥損傷息息相關(guān)。有研究表明， TLR4與小膠質(zhì)細(xì)胞自噬以及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[10]。TLR4是目前研究較多的 TLRs 家族成員。TLR4 在外源性或者內(nèi)源性配體的刺激作用下主要有兩條信號(hào)通路，這兩條信號(hào)通路分別是 MyD88 依賴途徑和 MyD88 非依賴途徑；在 MyD88 依賴途徑中活化的 TLR4 的胞內(nèi)區(qū)與下游 MyD88 的羧基端結(jié)合，激活下游 NIK(NF-κB 誘導(dǎo)激酶)，接著激活下游 IκB，最終激活NF-κB，而NF-κB p65是這條通路的重要蛋白，故 MyD88 依賴途徑即 TLR4/ MyD88/NF-κB 信號(hào)通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞自噬、炎癥損傷等多個(gè)方面[11-12]。NF-kB作為PI3K/Akt及Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路下游的主要效應(yīng)分子通過(guò)調(diào)控下游靶蛋白，密切參與凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞凋亡的過(guò)程[9-11]，激活后可密切參與凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞凋亡的過(guò)程[13-14],這最終導(dǎo)致了效應(yīng)性Caspase 3活化，胞核內(nèi)DNA鏈斷裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面解體，細(xì)胞死亡發(fā)生[15]。但關(guān)于TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬在腦出血炎癥損傷中的作用的研究較少，因此本研究將做進(jìn)一步探討。

圖3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6水平 與C組比較,*P<0.05;與D組比較,#P<0.05;與A組比較,&P<0.05

本研究結(jié)果表明， E組BWC和NDS較C組明顯下降； F組BWC和NDS較D組明顯下降。這說(shuō)明給予小鼠TLR4-siRNA進(jìn)行抑制后可有效減少小鼠腦內(nèi)腦組織含水量(即腦出血含量減少)，卻因阻斷TLR4/ MyD88/NF-κB 信號(hào)通路而加重腦出血小鼠的神經(jīng)功能障礙。TLR4-siRNA可抑制TLR4及其下游MyD88、NF-κB p65的表達(dá)，同時(shí)還可降低相關(guān)炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平。這說(shuō)明腦出血造模成功后機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)激狀態(tài)會(huì)引發(fā)機(jī)體Th1和Th2細(xì)胞免疫失衡，Th2細(xì)胞免疫活性呈過(guò)度增高狀態(tài)，血清和腦組織中TNF-α、IL-Iβ、和IL-6、等細(xì)胞炎性因子的水平顯著增高，激活刺激TLR4/NF-κB信號(hào)通路，加重嗜酸性粒細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)。自噬相關(guān)蛋白有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式。細(xì)胞漿內(nèi)分布LC3-Ⅰ，自噬體的標(biāo)記常使用LC3-Ⅱ，其反映了自噬體的數(shù)量和檢測(cè)標(biāo)志，主要受mTOR 激酶調(diào)節(jié)。使用自噬抑制劑3-MA后小膠質(zhì)細(xì)胞自噬水平下降，LC3-II/I比值降低，mTOR信號(hào)通路被阻斷和抑制，無(wú)法激活下游靶信號(hào)基因NF-κB，使得機(jī)體內(nèi)炎癥和免疫反應(yīng)紊亂，Th1和Th2細(xì)胞免疫失衡，炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平降低。綜上所述，TLR4-siRNA可抑制TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬，從而減輕自噬引起的腦出血炎癥損傷。