李運(yùn)奎 汪興杰 靳國杰 宋鴻聰 劉 浩 陶永勝

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院， 陜西楊凌 712100; 2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心， 陜西楊凌 712100)

0 引言

香氣物質(zhì)是葡萄酒重要的風(fēng)味物質(zhì)，按照來源不同，主要分為品種香氣物質(zhì)、發(fā)酵香氣物質(zhì)和陳釀香氣物質(zhì)，其中發(fā)酵香氣物質(zhì)主要來源于酵母主導(dǎo)的葡萄糖代謝路徑[1]。發(fā)酵香氣物質(zhì)中，酯類物質(zhì)是主要的呈香物質(zhì)，對(duì)果香有重要貢獻(xiàn)[2]。乙酸酯類物質(zhì)是由乙酸和醇類物質(zhì)在低pH值條件下反應(yīng)生成的一類重要酯類香氣物質(zhì)[3]，其中，乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯是葡萄酒中較為重要的乙酸酯類物質(zhì)[4]。乙酸乙酯和乙酸異戊酯在模擬葡萄酒中的嗅覺閾值分別為7.5 mg/L和30 μg/L[5]，在葡萄酒中的檢出量通常高于嗅覺閾值[5-6]，是果香的有力貢獻(xiàn)者[2-3]。乙酸苯乙酯同時(shí)也是重要的苯乙基類化合物，但在葡萄酒中的檢出量通常低于嗅覺閾值(250 μg/L)，因此在多數(shù)情況下與其他物質(zhì)聯(lián)合呈香[5]?？傮w上，由于嗅覺閾值相對(duì)較低，乙酸酯類物質(zhì)含量的微小變化可能會(huì)對(duì)葡萄酒香氣及感官質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響[3,7]。此外，乙酸酯類物質(zhì)的濃度與其相關(guān)高級(jí)醇濃度呈線性相關(guān)，即高級(jí)醇是乙酸酯類物質(zhì)生成的限制性前體物質(zhì)[8]。

通常情況下，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)的含量變化可為香氣物質(zhì)調(diào)控提供指導(dǎo)，建立相應(yīng)的香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型則可以更好地表征香氣物質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化，揭示香氣物質(zhì)的生成規(guī)律。已有研究中，分別基于Luedeking-Piret方程[9]、偶聯(lián)溫度、二氧化碳溶解量和初始酵母濃度等變量[10]和偶聯(lián)香氣物質(zhì)在氣液兩相中分配平衡常數(shù)的克勞修斯-克拉伯龍方程[11-14]建立了部分重要發(fā)酵香氣物質(zhì)(包括了部分乙酸酯及其高級(jí)醇)的生成動(dòng)力學(xué)模型。然而，現(xiàn)有模型中的特征參數(shù)很難被賦予明確的物理化學(xué)意義，極大地限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。此外，乙酸酯類及其相關(guān)的乙醇、乙酸和高級(jí)醇類物質(zhì)主要來源于葡萄糖代謝[1]，但現(xiàn)階段以葡萄糖為反應(yīng)底物，基于經(jīng)典化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論直接構(gòu)建香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型的報(bào)道很少。且研究表明，乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯是愛格麗干白葡萄酒中含量最高的3種乙酸酯類[15]。因此，本文以愛格麗葡萄汁為原料，接種商業(yè)釀酒酵母啟動(dòng)發(fā)酵，釀造干白葡萄酒。定時(shí)取樣監(jiān)測(cè)發(fā)酵葡萄汁的乙醇和乙酸含量變化，同時(shí)進(jìn)行重要乙酸酯類(乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯)及其相關(guān)高級(jí)醇類(異戊醇和苯乙醇)香氣物質(zhì)的SPME-GC-MS分析，從經(jīng)典化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)角度建立香氣物質(zhì)的生成動(dòng)力學(xué)模型，并結(jié)合目標(biāo)香氣物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到具體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以期為葡萄酒釀造過程中乙酸酯類香氣物質(zhì)生成的調(diào)控提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 酵母菌株與葡萄原料

釀酒酵母活性干粉ACTIFLORE F33(法國Laffort公司)。愛格麗葡萄原料于2015年9月12日采自陜西楊凌官村葡萄基地(108° 4′27.95″E，34°16′ 56.24″N)，葡萄漿果糖度(以葡萄糖計(jì))為(177.0±1.2)g/L，酸度(以酒石酸計(jì))為(6.84±0.22)g/L。

1.2 儀器與試劑

TRACE 1310-ISQLT型GC-MS聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；DB-WAXETR型氣相色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent J&W公司)；50 μm/30 μm CAR/DVB/PDMS型萃取頭(美國Supelco公司)；FA2014N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；DGX-9243BC型鼓風(fēng)干燥箱(上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)，Millipore型純水制備儀(美國Bedlford公司)。

分析純?cè)噭簹溲趸c(廣州金華大化學(xué)試劑有限公司)，葡萄糖(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，亞硫酸(SO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%以上，天津天力化學(xué)試劑有限公司)。色譜純?cè)噭寒愇齑?純度99%以上)、苯乙醇(純度99%以上)、乙酸乙酯(純度99.9%以上)、乙酸異戊酯(純度99%以上)、乙酸苯乙酯(純度98%以上)和2-辛醇(純度99%以上)(Sigma-Aldrich上海公司)。

1.3 愛格麗干白葡萄酒釀造

愛格麗葡萄除梗破碎后，葡萄汁裝于20 L玻璃發(fā)酵罐中，按 60 mg/L添加SO2。葡萄汁4℃靜置12 h后，分離上層澄清葡萄汁，當(dāng)自然升溫至15℃，按200 mg/L添加活性干酵母，啟動(dòng)酒精發(fā)酵。添加白砂糖調(diào)整最終酒精度，控制發(fā)酵溫度在15～18℃。當(dāng)發(fā)酵葡萄汁的比重處于0.992～0.996且殘?zhí)堑陀? g/L時(shí)，終止發(fā)酵，葡萄酒轉(zhuǎn)入干凈玻璃罐中，按50 mg/L補(bǔ)加SO2，4℃下密封貯藏。期間進(jìn)行2～3次自然澄清轉(zhuǎn)罐處理，最后，葡萄酒滿罐密封于4℃存放直至分析。葡萄酒釀造實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。發(fā)酵過程中測(cè)定還原糖、乙醇和揮發(fā)酸含量的變化，測(cè)定方法參照GB/T 15038—2006，每次測(cè)定重復(fù)3次。

1.4 香氣成分分析

香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品于模擬葡萄酒溶液(體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇，6 g/L酒石酸，pH值3.2)中配置成5個(gè)不同的濃度，配置完成后，所有溶液4℃條件下避光保存[16]。香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品中的目標(biāo)香氣物質(zhì)均采用SPME-GC-MS分析[17]，重復(fù)測(cè)定3次。

SPME方法：在15 mL裝有磁力攪拌子的頂空瓶中加入8 mL酒樣(含內(nèi)標(biāo)物2-辛醇，0.4 mg/L)或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入2.0 g NaCl，然后將頂空瓶放入電磁攪拌器上水浴，40℃條件下平衡15 min；插入萃取纖維，40℃吸附30 min，立即將萃取頭在GC進(jìn)樣口解吸8 min，用于GC-MS分析。

GC-MS條件：無分流進(jìn)樣；色譜柱DB-WAXETR升溫程序?yàn)橐?.0℃/min的速度從40℃升至130℃，再以4℃/min的速度從130℃升至250℃，保持8 min。離子源溫度250℃，連接桿溫度250℃，進(jìn)樣口溫度250℃，電壓70 eV，質(zhì)譜掃描范圍25～350，掃描速率0.2次/s。

香氣物質(zhì)的定性分析采用與香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖特征離子比對(duì)、Wiley 275.L譜庫(Agilent Technologies公司)查詢等方法進(jìn)行。定量分析采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行，香氣物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過五點(diǎn)標(biāo)度法獲得[15]。

1.5 香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建

葡萄酒釀造中，發(fā)酵香氣成分的生成主要來源于葡萄糖的代謝[1]，因此，本研究以葡萄糖為反應(yīng)底物(初始濃度CG0)，t時(shí)刻生成的某香氣物質(zhì)(計(jì)量系數(shù)為f)濃度為CP。根據(jù)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論[18]，該香氣物質(zhì)生成反應(yīng)的表觀速率方程微分形式可寫為

(1)

式中r——速率

k——速率常數(shù)，mmol1-n/(L1-n·d)

CG——t時(shí)刻的葡萄糖濃度，mmol/L

n——反應(yīng)表觀級(jí)數(shù)，表征反應(yīng)物對(duì)反應(yīng)速率的影響程度

對(duì)式(1)兩邊做定積分，則

(2)

當(dāng)n≠1時(shí)(非一級(jí)反應(yīng))，由式(2)可得

(3)

由式(3)得速率常數(shù)k(n≠1時(shí))計(jì)算公式為

(4)

式(3)即為由葡萄糖生成香氣物質(zhì)的非一級(jí)反應(yīng)表觀速率方程積分形式的通式。

當(dāng)n=1時(shí)(一級(jí)反應(yīng))，由式(2)可得

(5)

式(5)即為由葡萄糖生成香氣物質(zhì)的一級(jí)反應(yīng)表觀速率方程積分形式的通式。由式(5)得速率常數(shù)k(n=1時(shí))的表達(dá)式為

(6)

相比于香氣物質(zhì)濃度隨時(shí)間變化的C-t圖及對(duì)其變化趨勢(shì)的擬合圖，香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型的建立能揭示香氣物質(zhì)生成的更多信息，如：速率方程可以給出香氣物質(zhì)濃度隨時(shí)間的變化情況(這類似于擬合函數(shù)的作用)；反應(yīng)級(jí)數(shù)可以表征葡萄糖初始濃度對(duì)香氣物質(zhì)生成速率的影響，級(jí)數(shù)越大，影響越大；速率常數(shù)則可以表征香氣物質(zhì)生成的速率及各種因素對(duì)反應(yīng)速率的影響。反應(yīng)溫度、發(fā)酵液組成、催化劑等因素對(duì)香氣生成的影響，由速率常數(shù)k體現(xiàn)，如溫度的影響可通過阿倫尼烏斯公式進(jìn)行描述。

采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和檢驗(yàn)，采用Origin Pro繪制相關(guān)曲線。

2 結(jié)果與討論

愛格麗酒樣的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度(以葡萄糖計(jì))為(2.21±0.15)g/L，酸度(以酒石酸計(jì))為(6.45±0.36)g/L。發(fā)酵進(jìn)行順利，乙醇體積分?jǐn)?shù)和揮發(fā)酸質(zhì)量濃度(以乙酸計(jì))均呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，最終生成量分別為(11.83±0.19)%和(398±14)mg/L。

2.1 發(fā)酵過程中目標(biāo)香氣物質(zhì)檢出量

乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯分別由乙醇、異戊醇和苯乙醇與乙酸反應(yīng)生成。通常情況下，乙醇和乙酸并不被認(rèn)為是香氣物質(zhì)，因此本文僅對(duì)異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯5種目標(biāo)香氣物質(zhì)進(jìn)行分析研究。

發(fā)酵過程中目標(biāo)香氣物質(zhì)的檢出量如表1所示。醇類物質(zhì)的檢出量普遍高于乙酸酯類物質(zhì)，但除乙酸異戊酯外，其他香氣物質(zhì)的檢出量在發(fā)酵后期均有一定幅度下降。MOURET等[8]在研究中認(rèn)為香氣物質(zhì)的開始生成期和終止生成期分別為檢出量超過最大檢出量10%和90%的時(shí)期。結(jié)合香氣物質(zhì)的測(cè)定時(shí)間間隔，定義香氣物質(zhì)的開始生成期為香氣物質(zhì)檢出量達(dá)到最大檢出量0～10%的測(cè)定時(shí)期，另外，由于香氣物質(zhì)在最大檢出量時(shí)的生成量與損失量基本相互抵消，因此定義香氣物質(zhì)的終止生成期為香氣物質(zhì)的最大檢出量時(shí)期。分析可知，在本文條件下，異戊醇、苯乙醇和乙酸乙酯的檢出量在發(fā)酵的第2天未達(dá)到最大檢出量的10%，因此這一時(shí)期即為這3種物質(zhì)的開始生成期，乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯在發(fā)酵第2天的檢出量分別達(dá)到了最大檢出量的12.1%和10.4%，因此這兩種物質(zhì)的生成時(shí)期與發(fā)酵時(shí)期一致。另外，5種目標(biāo)香氣物質(zhì)分別在發(fā)酵的第16、12、16、20、12天達(dá)到最大檢出量，即這一發(fā)酵時(shí)刻為香氣物質(zhì)的終止生成期。

香氣物質(zhì)在發(fā)酵過程中的香氣活性值變化如圖1所示。乙酸苯乙酯和苯乙醇以及乙酸異戊酯和異戊醇的香氣活性值變化趨勢(shì)相同，這也表明了酯類物質(zhì)與其前體物質(zhì)的含量生成變化基本具有一致性。乙酸異戊酯、苯乙醇、異戊醇和乙酸異戊酯的香氣活性值分別在發(fā)酵的第2、4、6、12天達(dá)到或超過1，但乙酸苯乙酯在香氣活性值大于1后，含量即降低至嗅覺閾值以下。另有研究表明，控制發(fā)酵溫度在18～20℃時(shí)，愛格麗葡萄酒中乙酸苯乙酯的最終質(zhì)量濃度會(huì)超過400 μg/L，而苯乙醇的檢出量較之本研究(發(fā)酵溫度15～18℃)中略有降低[15]。這表明，發(fā)酵溫度對(duì)乙酸苯乙酯的生成可能有一定影響。而通常情況下，苯乙醇、乙酸苯乙酯和乙酸乙酯對(duì)花香或果香有重要貢獻(xiàn)，因此，在發(fā)酵過程中，對(duì)苯乙醇、乙酸苯乙酯和乙酸乙酯的生成進(jìn)行調(diào)控，對(duì)果香和花香香氣的強(qiáng)化有一定積極作用。乙酸乙酯在本研究中檢出量一直低于其嗅覺閾值，這與WANG等[15]、李娜娜等[19-20]、南立軍[21]對(duì)愛格麗干白葡萄酒香氣的研究結(jié)果一致，說明這可能是愛格麗葡萄的品種特性，且以上研究表明愛格麗干白葡萄酒中乙酸乙酯的含量還受采收時(shí)間、發(fā)酵前葡萄預(yù)處理溫度甚至葡萄整形方式的影響。究其原因，可能是愛格麗葡萄漿果中酵母營養(yǎng)成分尤其是可同化氮的差異，造成釀酒酵母乙酸乙酯的合成代謝減少。該品種葡萄酒中乙酸乙酯的酵母代謝生成的調(diào)控值得深入研究。

表1 目標(biāo)香氣物質(zhì)在發(fā)酵過程中的檢出量(質(zhì)量濃度) Tab.1 Detected concentration of objective aroma compounds during fermentation mg/L

圖1 目標(biāo)香氣物質(zhì)在發(fā)酵過程中的香氣活性值變化 Fig.1 Changes of odor activity value for considered aroma during fermentation

2.2 目標(biāo)香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型建立

為進(jìn)一步研究香氣物質(zhì)的生成動(dòng)力學(xué)特征，對(duì)香氣物質(zhì)的開始生成期Tint、半生成期t1/2及其在整個(gè)發(fā)酵周期中所處時(shí)期Thalf、終止生成期Ttmt和生成周期Tdrt等特征參數(shù)進(jìn)行了定義和推導(dǎo)。

(7)

(8)

香氣物質(zhì)的半生成期直觀給出了生成一半香氣物質(zhì)需要的時(shí)間，與速率常數(shù)類似可表征反應(yīng)速率。香氣物質(zhì)半生成期在整個(gè)發(fā)酵周期中所處時(shí)期Thalf為

Thalf=t1/2+Tint

(9)

式中Tint——在整個(gè)發(fā)酵周期中香氣物質(zhì)開始生成的時(shí)期

香氣生成周期Tdrt為

Tdrt=Ttmt-Tint

(10)

本文中生成動(dòng)力學(xué)模型的擬合結(jié)果表明，香氣物質(zhì)從開始生成到最大生成量這一時(shí)期的濃度變化符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，即香氣物質(zhì)濃度變化與發(fā)酵時(shí)間呈良好的線性相關(guān)。即當(dāng)n=0時(shí)(零級(jí)反應(yīng))，式(4)可簡(jiǎn)化為

CP=kt

(11)

則速率常數(shù)k為

(12)

依據(jù)式(11)和式(12)建立的目標(biāo)香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型表達(dá)式和速率常數(shù)k如表2所示。模型決定系數(shù)R2>0.95，顯著性水平P<0.001，目標(biāo)香氣成分的實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值和模型預(yù)測(cè)值符合良好(圖2)，表明動(dòng)力學(xué)模型結(jié)果良好。

表2 香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型的表達(dá)式與速率常數(shù) Tab.2 Expressions and rate constants of production kinetic models for objective aroma compounds

圖2 目標(biāo)香氣成分的實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值和線性回歸預(yù)測(cè)值 Fig.2 Observed values and linear regression predicted values of objective aroma compounds

本文僅對(duì)目標(biāo)香氣物質(zhì)從開始生成到最大生成量階段的生成動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)建模，模型的表達(dá)式為零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，但通常情況下，香氣物質(zhì)含量在發(fā)酵后期均有一定幅度下降或保持穩(wěn)定[8]，因此對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)含量變化建立的動(dòng)力學(xué)模型研究中，均未出現(xiàn)零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，而這還可能與不同研究中發(fā)酵體系和發(fā)酵周期等的差異有關(guān)[8,13-14]。另外，相比于基于克拉伯龍-克勞修斯方程[12]、Luedeking-Piret方程[9]以及偶聯(lián)溫度、二氧化碳溶解量和初始酵母濃度等變量建立的模型[10]，本文建立的生成動(dòng)力學(xué)模型僅與香氣物質(zhì)生成量和葡萄糖含量有關(guān)，模型變量減少。

目標(biāo)香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型的動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)分析結(jié)果如表3所示?？傮w上，目標(biāo)香氣物質(zhì)之間的特征參數(shù)值差異較大，這可能與香氣物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)不同有關(guān)[23]。異戊醇和乙酸異戊酯是香氣活性值較高的香氣物質(zhì)。其中，異戊醇的生成速率最快，通常在高級(jí)醇中含量也最多[5,24]。異戊醇的Thalf為8.8 d，Tdrt為14 d，而乙酸異戊酯的Thalf為10.2 d，Tdrt為20 d，因此，乙酸異戊酯生成相比于其限制性反應(yīng)底物異戊醇，有延滯效應(yīng)。

表3 香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型中的特征參數(shù) Tab.3 Kinetics characteristic parameters of objective aroma compounds d

動(dòng)力學(xué)模型揭示出，乙酸乙酯的生成速率是3種酯類物質(zhì)中最高的，這可能與其反應(yīng)底物乙醇和acetyl-CoA均大量來源于葡萄糖代謝有關(guān)[1,3]，而乙酸苯乙酯生成速率最慢則可能與苯乙醇的含量較低有關(guān)。乙酸乙酯的Thalf為9.1 d，Ttmt為16 d，而其反應(yīng)底物乙醇和乙酸含量在16 d也分別達(dá)到了最大值，但乙酸乙酯的檢出量仍然低于嗅覺閾值。文獻(xiàn)[25]指出14℃釀造環(huán)境下，乙酸乙酯的生成量要高于22℃時(shí)，因此本研究的發(fā)酵溫度可能是限制乙酸乙酯生成的一個(gè)重要因素。動(dòng)力學(xué)模型揭示出，苯乙醇的生成周期比乙酸苯乙酯短。作為乙酸苯乙酯生成的限制性底物，苯乙醇主要來源于酵母代謝的莽草酸途徑[26-27]。因此，在本文條件下，可嘗試在乙酸乙酯和乙酸苯乙酯生成的發(fā)酵Thalf時(shí)期，補(bǔ)加達(dá)到目標(biāo)酒度所需的糖分，或適當(dāng)添加酵母生長(zhǎng)劑，促進(jìn)乙酸、乙醇和苯乙醇的生成量，并延長(zhǎng)苯乙醇的生成周期，從而達(dá)到提高乙酸乙酯和乙酸苯乙酯生成的作用。

2.3 目標(biāo)香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

圖3 標(biāo)準(zhǔn)化殘差檢驗(yàn)與診斷的散點(diǎn)圖 Fig.3 Scatter diagrams of rigorous statistical diagnosis for standardized residual

為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)目標(biāo)香氣物質(zhì)的生成動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行了嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。其中，模型的殘差分析結(jié)果如表4所示。顯著性水平Sig.值的結(jié)果表明，目標(biāo)香氣物質(zhì)的Levene方差同質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果的顯著性均大于0.05，因此可認(rèn)為該殘差序列方差齊。Durbin-Watson統(tǒng)計(jì)量的分析結(jié)果均在0～4范圍內(nèi)，且絕大部分在2附近，表明殘差獨(dú)立性強(qiáng)。殘差正態(tài)性檢驗(yàn)K-S統(tǒng)計(jì)量分析結(jié)果表明，目標(biāo)香氣物質(zhì)的顯著性均大于0.05，則可認(rèn)為該殘差序列服從正態(tài)或近似正態(tài)分布。因此，殘差分析結(jié)果表明，目標(biāo)香氣物質(zhì)的回歸模型成立。

此外，標(biāo)準(zhǔn)化殘差的散點(diǎn)圖如圖3所示，殘差值經(jīng)擬合所得直線平行(重合)于橫坐標(biāo)，說明殘差的方差齊。而標(biāo)準(zhǔn)化殘差隨機(jī)分布在(-2, 2)范圍內(nèi)，說明殘差序列與預(yù)測(cè)值序列無關(guān)，變量間無非線性關(guān)系、沒有重要自變量未進(jìn)入模型，無實(shí)驗(yàn)異常點(diǎn)，殘差獨(dú)立。標(biāo)準(zhǔn)化殘差的P-P圖如圖4所示。實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化殘差在(-2, 2)區(qū)間以外無分布(概率小于等于0.05)，說明無實(shí)驗(yàn)異常點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)化殘差點(diǎn)近似在一條直線上，直線的斜率為標(biāo)準(zhǔn)差(1)，截距為均值(0)，說明鑒別樣本數(shù)據(jù)近似于正態(tài)分布，且數(shù)據(jù)點(diǎn)的隨機(jī)分布表明殘差獨(dú)立。綜上，統(tǒng)計(jì)診斷結(jié)果表明，目標(biāo)香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型成立。

表4 香氣物質(zhì)生成動(dòng)力學(xué)模型的殘差分析 Tab.4 Residual analysis of kinetic models for objective aroma compounds

注：顯著性水平Sig.值為殘差方差齊性檢驗(yàn)Levene統(tǒng)計(jì)量，將待檢驗(yàn)的殘差序列按大小順序分為兩組，再進(jìn)行Levene方差同質(zhì)性檢驗(yàn)，顯著性Sig.值大于0.05則認(rèn)為該殘差序列方差齊；Durbin-Watson統(tǒng)計(jì)量取值為0～4，其值越接近2，則殘差獨(dú)立性越強(qiáng)；K-S 統(tǒng)計(jì)量大于0.05則認(rèn)為該殘差序列服從正態(tài)或近似正態(tài)分布

圖4 標(biāo)準(zhǔn)化殘差檢驗(yàn)與診斷的P-P圖 Fig.4 P-P diagrams of rigorous statistical diagnosis for standardized residual

總體上，現(xiàn)階段乙酸酯類及其高級(jí)醇類香氣物質(zhì)的生成動(dòng)力學(xué)模型研究中，異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸異戊酯是主要研究對(duì)象[8,10,13]，這可能與它們的檢出量通常高于嗅覺閾值，從而表現(xiàn)為香氣活性物質(zhì)有關(guān)[5-6]。而乙酸苯乙酯在葡萄酒中檢出量通常低于嗅覺閾值[5]，這可能是乙酸苯乙酯的相關(guān)生成動(dòng)力學(xué)模型研究欠缺的主要原因。因此，本研究結(jié)果可作為前人研究的補(bǔ)充，同時(shí)為重要乙酸酯類物質(zhì)的生成、預(yù)測(cè)和調(diào)控提供數(shù)據(jù)支撐。

3 結(jié)束語

基于經(jīng)典化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理構(gòu)建了發(fā)酵香氣物質(zhì)的生成動(dòng)力學(xué)模型，并得到了愛格麗葡萄汁發(fā)酵過程中的重要乙酸酯類(乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯)及其相關(guān)高級(jí)醇類(異戊醇和苯乙醇)的生成動(dòng)力學(xué)具體形式及性質(zhì)。研究結(jié)果表明，乙酸酯類香氣物質(zhì)的生成具有零級(jí)動(dòng)力學(xué)特征(R2>0.95，P<0.001)。動(dòng)力學(xué)模型揭示出，乙酸乙酯的生成與乙醇和乙酸具有同時(shí)性，而乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的生成分別相對(duì)于異戊醇和苯乙醇有延滯效應(yīng)。為調(diào)控增加香氣活性較弱的乙酸苯乙酯和乙酸乙酯的生成，可適當(dāng)在發(fā)酵較為旺盛的半生成期，調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)成分，促進(jìn)酵母代謝產(chǎn)物生成，提高乙酸酯類香氣物質(zhì)的前體物質(zhì)的生成量，并延長(zhǎng)其生成周期。