江連洲 佟曉紅 劉寶華 王 歡 張巧智 李 楊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

作為一種可以替代溶劑浸出法的綠色提油技術(shù)，生物解離是通過機(jī)械破碎聯(lián)合酶解作用于油料，使油脂從油料固體中釋放出來，所提取的油脂品質(zhì)較高、色澤較好[1]。生物解離得到的大豆蛋白及肽主要存在于離心得到的水解液中[2]。大豆約80%的總蛋白質(zhì)被存儲在稱為蛋白質(zhì)體的細(xì)胞器中，它占據(jù)子葉細(xì)胞大部分體積，而且大豆油脂儲存在油脂體中，油脂體的鑲嵌蛋白與磷脂相互結(jié)合并協(xié)同作用，使其內(nèi)部的油脂體不易分解，因此，通過蛋白酶酶解更有助于油脂釋放[3]。生物解離過程中酶水解會造成大豆蛋白質(zhì)帶電基團(tuán)的增加，分子量變小，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此其功能性質(zhì)(如溶解性、起泡性、乳化性和凝膠特性等)會發(fā)生變化[4]。蛋白酶解物中小肽通過小腸吸收的速度比同樣氨基酸組成的游離氨基酸混合物更快、更均勻，并且具有更高的營養(yǎng)價值[5]。但是，蛋白經(jīng)過酶水解可導(dǎo)致苦味肽的形成，影響其在食品中的應(yīng)用，特別是蛋白質(zhì)水解物應(yīng)用于飲料中會產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響[6]。因此，本文研究7種食品級商業(yè)蛋白酶制劑(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶)對生物解離油脂提取率、得到的蛋白質(zhì)水解物苦味和功能特性的影響。通過氨基酸分析、凝膠電泳、水解度及感官評價對苦味進(jìn)行分析，同時，通過水解度和傅里葉紅外光譜對樣品功能性(溶解性和乳化性)進(jìn)行分析，探討不同酶種類對其功能性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擠壓膨化大豆(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù) 40%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù) 17%，纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù) 7%)，山東省高唐藍(lán)山集團(tuán)總公司；堿性蛋白酶Protex 6 L，杰能科(中國)生物工程有限公司；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、彩虹光譜蛋白Marker，北京索萊寶科技有限公司；復(fù)合蛋白酶，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；奎寧，上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器，廣州儀科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室 pH 計(jì)，中國上海雷磁公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；GL-21M 型高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；3-18K 型高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī)，美國SIM公司；UV-1600PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；Mini-PROTEAN Trtra型垂直電泳槽，Bio-Rad 公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；MAGNA-IR560 型傅里葉紅外光譜儀，美國尼高麗公司。

1.3 生物解離大豆蛋白酶解物的制備

參考LI等[6]的方法制備生物解離大豆蛋白酶解物，主要流程如下：擠壓膨化大豆→粉碎→過篩(60目)→調(diào)節(jié)液固比為 6 mL/mg→調(diào)節(jié)溫度、pH值→酶解(3 h，酶添加量為1 mL/(100 g)或1 g/(100 g))→滅酶(100 ℃，10 min)→離心分離(8 000g、20 min)→得到水解液→冷凍干燥→脫脂(正己烷)→得到大豆蛋白酶解物。

1.4 蛋白水解度的測定

依據(jù) NIELSEN等[7]的方法，即鄰苯二甲醛(Ortho-phthalaldehyde，OPA)法。將上述制得酶解物用0.1 mol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制，樣品溶液與OPA試劑充分混勻5 s，準(zhǔn)確靜止2 min，用可見光分光度計(jì)在340 nm下測定其吸光度。試驗(yàn)重復(fù) 3 次取平均值，蛋白質(zhì)水解度計(jì)算公式為

(1)

式中h——水解的肽鍵數(shù)

htot——總肽鍵數(shù)(大豆取7.8[8])

1.5 SDS-PAGE凝膠電泳

參考LAEMMLI[9]的方法略作修改：分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL，上樣前于沸水浴中加熱5 min，上樣量為10 μL，電泳電壓初始為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠時，提高電壓至120 V。電泳后用考馬斯亮藍(lán)R250溶液染色，而后用脫色液脫色4～5次，脫色完全后，采用Gel Doc EZ imager型凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶。

1.6 氨基酸組成分析

大豆蛋白酶解物的氨基酸組成利用氨基酸分析儀進(jìn)行測定，樣品用6 mol/L鹽酸封管，在110℃條件下水解24 h，過濾后進(jìn)行真空干燥，溶解后上機(jī)分析，進(jìn)樣量為50 μL。所測結(jié)果用占蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示[10-11]。游離氨基酸測定時，樣品用10%三氯乙酸沉淀2 h，然后在11 000g下離心15 min，調(diào)節(jié)pH值為2.0，過濾后利用氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

1.7 傅里葉紅外光譜測定

傅里葉紅外光譜測定采用KBr壓片法，準(zhǔn)確稱取蛋白酶解物樣品1 mg，加入KBr 100 mg，充分研磨約15 min后進(jìn)行壓片處理，在室溫(20℃)條件下，掃描波數(shù)譜段設(shè)定為400～4 000 cm-1，設(shè)定分辨率為4 cm-1、波數(shù)精度為0.01 cm-1條件下掃描64次，重復(fù)3次。利用Peakfit Version軟件處理譜圖[12]。

1.8 蛋白質(zhì)功能特性測定

1.8.1溶解性

參照MORR等[13]的方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取20 mg樣品溶于10 mL去離子水中，攪拌1 h后在20 000 r/min條件下離心15 min。分別測定上清液蛋白質(zhì)含量及樣品總蛋白含量。溶解度表示為上清液中蛋白濃度與總蛋白質(zhì)濃度的比值。

1.8.2乳化活性和乳化穩(wěn)定性

參照DOMBROWSKI等[14]的方法測定蛋白酶解物樣品的乳化活性指數(shù)( Emulsifying activity index，EAI)及乳化穩(wěn)定性指數(shù)( Emulsifying stability index，ESI)并稍作修改: 將樣品溶液與大豆油按體積比3∶1混合，用高速均質(zhì)機(jī)在20 000 r/min下均質(zhì)1 min使其混合均勻。立即準(zhǔn)確吸取乳狀液50 μL與5 mL 0.1%的SDS溶液混合均勻，記錄此時及30 min后在500 nm處的吸光度，乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)計(jì)算公式為

(2)

(3)

式中EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

N——稀釋倍數(shù)

C——乳液在形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/mL

φ——乳狀液中油相體積分?jǐn)?shù)，%

A0——0 min時的吸光度

A30——30 min時的吸光度

1.9 感官評價

將不同酶酶解產(chǎn)物用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度0.01 g/mL的樣品溶液。不同濃度的奎寧溶液作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[15]。標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0、8×10-6、1.6×10-5、2.4×10-5、3.2×10-5、4×10-5g/mL，對應(yīng)的分值為0、1、2、3、4、5分，苦味越重，分值越高。將樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫下進(jìn)行對比，并按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，選擇10名訓(xùn)練有素的感官評定小組成員(5名男性和5名女性，年齡在20～35歲之間)來評估水解產(chǎn)物的苦味[5]。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，利用ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析，并用Origin 8.0和Excel等統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并制圖，P<0.05時為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物解離提油率分析

表1為不同酶種類對大豆生物解離提油效果的影響，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶及胰蛋白酶解離后提油率分別為91.23%、86.19%、74.45%、75.68%、87.73%、89.44%及79.93%，堿性蛋白酶提油率最高，中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及復(fù)合蛋白酶的提油率相似，并且與堿性蛋白酶提油率相近。木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及胰蛋白酶的提油率不理想。

表1 不同酶解條件對大豆提油率的影響 Tab.1 Effect of different enzyme hydrolysis conditions on soybean oil extraction rate

2.2 水解度分析

經(jīng)過計(jì)算可知，堿性蛋白酶處理得到的大豆蛋白酶解物水解度最大為15.4%，其次是復(fù)合蛋白酶12.8%，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解度相近，分別是10.6%、11.1%，兩種植物來源的蛋白酶——木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的水解度分別是9.2%、7.6%，胰蛋白酶的水解度最低，為3.3%，這可能歸因于胰蛋白酶抑制劑的存在，抑制了胰蛋白酶的蛋白水解作用[16]。

2.3 SDS-PAGE凝膠電泳分析

圖1是大豆分離蛋白(SPI)和不同酶處理后大豆蛋白酶解物的SDS-PAGE圖，大豆蛋白的主要組分是β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白主要含有3個亞基，分別是α′(67～72 kDa)、α(63 kDa)和β亞基(47 kDa)；大豆球蛋白由酸性亞基A(29～33 kDa)和堿性亞基B(22 kDa)兩個亞基組成[17]。如圖1所示，相對于SPI，所有大豆蛋白酶解物中均有許多低分子量的肽片段存在，其中在堿性蛋白酶的作用下，大豆蛋白的α′、α、β亞基和酸性亞基A都基本被水解，由于堿性基團(tuán)位于大豆球蛋白復(fù)合物內(nèi)部，因此不易水解，相反，位于復(fù)合體外部的酸性亞基幾乎全部被蛋白酶降解為小分子肽[4]。胰蛋白酶也同樣作用于β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白，但仍有大部分未被水解，這可能由于胰蛋白酶的特異性較強(qiáng)。菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解物的酶解程度相似，這與它們的水解度相似存在關(guān)聯(lián)。中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物的β-伴大豆球蛋白組分幾乎被破壞，生成小分子肽。

圖1 不同酶解條件下水解液蛋白的 SDS-PAGE Fig.1 SDS-PAGE of proteins in skim under different enzymolysis conditions

2.4 氨基酸組成分析

疏水性氨基酸為側(cè)鏈具有高疏水性氨基酸的總稱，蛋白水解所釋放出含有的疏水性氨基酸殘基的短肽是產(chǎn)生苦味的主要原因，特別是含有長鏈的芳香族氨基酸殘基。一般情況下，疏水性基團(tuán)都埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部，因此不會產(chǎn)生苦味。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解為小分子短肽時疏水性氨基酸的含量越高，接觸味蕾產(chǎn)生的苦味越強(qiáng)，苦味氨基酸上有苦味產(chǎn)生的結(jié)合位點(diǎn)和刺激位點(diǎn)，當(dāng)苦味氨基酸的比例較高時，其產(chǎn)生苦味可能性較大。但總疏水氨基酸和總苦味氨基酸所占比例對苦味的影響還需要進(jìn)一步驗(yàn)證[18]。由表2可知，從疏水性氨基酸和苦味氨基酸的比例來看，堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解物中所含比例較大，這與其在感官評定中苦味值結(jié)果相一致。風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶酶解物中所含比例較小，這與其在感官評定中苦味值結(jié)果相一致[5]。

表2 不同大豆蛋白酶解物中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) Tab.2 Amino acid composition of different soybean protein hydrolysates %

2.5 傅里葉紅外光譜分析

圖2 不同酶解蛋白的紅外光譜分析 Fig.2 FT-IR spectra analysis of different enzymatic proteins

構(gòu)對應(yīng)波數(shù)1 664～1 681 cm-1；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)對應(yīng)波數(shù)1 637～1 645 cm-1。采用peakfit軟件對酰胺Ⅰ帶進(jìn)行去卷積和高斯曲線擬合，通過峰位歸屬確定二級結(jié)構(gòu)種類和相對含量，計(jì)算結(jié)果見表3。

大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，相對含量為51.03%，α-螺旋相對含量為15.53%，β-轉(zhuǎn)角相對含量為22.68%，無規(guī)則卷曲相對含量為10.76%。堿性蛋白酶酶解得到的大豆蛋白酶解物二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲相對含量為31.80%，相對于其他酶最高，風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶及中性蛋白酶條件下無規(guī)則卷曲相對含量相近，分別為20.52%、20.42%及20.40%，木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及胰蛋白酶條件下無規(guī)則卷曲相對含量依次減小，為18.59%、15.72%及13.71 %，蛋白酶解物的無規(guī)則卷曲相對含量都比大豆分離蛋白高。除了胰蛋白酶特殊外，隨著無規(guī)則卷曲相對含量的增加，β-折疊變化規(guī)律相反。與上文水解度對比可以看出，總體趨勢上無規(guī)則卷曲相對含量越大水解度越高[21]。無規(guī)則卷曲主要是由β-折疊及β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化而來，不同酶的酶解位點(diǎn)及水解度的不同是酶解后二級結(jié)構(gòu)組成存在差異的主要原因，蛋白質(zhì)的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為其良好表面性質(zhì)及乳液穩(wěn)定性等提供了柔性結(jié)構(gòu)單元[22]。

表3 不同酶解蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量 Tab.3 Relative content of the secondary structure of different enzymatic proteins %

2.6 溶解性分析

蛋白質(zhì)溶解性是非常重要的功能特性，它對其他功能特性，尤其是乳化性、凝膠化及起泡性有相當(dāng)大的影響，與SPI相比，酶解可以提高蛋白質(zhì)的溶解性，這是因?yàn)榈鞍捉?jīng)過酶解后，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被局部展開、改善了分子柔性，促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的舒張，溶解性因此得到提高[23]。堿性蛋白酶酶解樣品的溶解性最好，為91.12%，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及復(fù)合蛋白酶酶解樣品的溶解性分別為84.09%、83.43%、79.2%、87.12%及89.4%，所有酶解樣品中，胰蛋白酶處理的溶解性(70.98%)最差，因?yàn)橄嗤附鈺r間下，堿性蛋白酶的水解度最高，蛋白質(zhì)被酶解形成更小的多肽，分子量的降低及比表面積的增大使水合作用變強(qiáng)，因此溶解度最大。研究表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化程度、小肽的釋放以及可電離氨基和羧基的增加是增加樣品與水分子相互作用、溶解度增加的原因[24]。

2.7 乳化性分析

乳化活性指數(shù)表征機(jī)械攪拌作用后互不相溶的液體形成乳液的能力；乳化穩(wěn)定性指數(shù)表征乳液中乳滴的穩(wěn)定能力。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)是大豆蛋白非常重要的表面性質(zhì)之一，在食品加工過程中起到了重要的作用。如圖3所示，除了堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶外，其他蛋白酶解物的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)相對于SPI均增加，風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的乳化活性指數(shù)為185.06、173.12、158.23、143.05、121.8 m2/g。CALDERON 等[25]證實(shí)大豆蛋白經(jīng)蛋白酶水解后乳化活性增加。乳化特性的增加可能是由于大分子蛋白質(zhì)的降解，疏水基團(tuán)的暴露和蛋白質(zhì)溶解度的提高，從而提高了蛋白質(zhì)的表面活性，因此具有更好的乳化活性[26]。蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為其良好表面性質(zhì)及乳液穩(wěn)定性等提供了柔性結(jié)構(gòu)單元[27]，由表3可知，酶解后無規(guī)則卷曲相對含量增多，原理上酶解產(chǎn)物的乳化性會得到提高。然而，與未水解的SPI相比，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)均降低，其原因可能是由于蛋白質(zhì)的過度水解，如水解度和SDS-PAGE結(jié)果表明，蛋白水解程度較大，亞基降解成大量小分子肽。據(jù)報(bào)道，水解物的乳化性與水解程度密切相關(guān)，低水解度乳化性增加和高水解度乳化性降低[28]。但是也不是絕對的，盡管風(fēng)味蛋白酶酶解物的水解度也較大，為11.05%，但是乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)卻最大，分別為185.06 m2/g和78.9 min。

圖3 不同酶解條件下水解液蛋白的乳化性 Fig.3 Emulsion activity index and stability index of proteins in skim under different enzymolysis conditions

2.8 感官評價分析

當(dāng)?shù)鞍酌该附獾鞍踪|(zhì)時，大量生成由疏水性氨基酸殘基形成的小肽，會產(chǎn)生強(qiáng)烈的苦味。根據(jù)之前研究得出，多肽自身的疏水性、氨基酸序列、分子量及空間結(jié)構(gòu)可能影響水解物的苦味[29]。經(jīng)過堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶及胰蛋白酶解離后，樣品的苦味值分別為4.0、3.5、2.0、2.0、1.5、2.5、1.5。酶種類水解大豆蛋白產(chǎn)生的苦味值存在明顯差異，苦味最強(qiáng)的是堿性蛋白酶處理得到的酶解蛋白，其次是中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶的酶解蛋白，苦味最弱的為風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶的酶解蛋白。由水解度和SDS-PAGE可知，堿性蛋白酶的水解程度最大，分子量小的肽較多，通過氨基酸組成分析可知，疏水性氨基酸和苦味氨基酸在蛋白酶解物樣品中比例最高，這是因?yàn)槭杷园被釟埢聂然穗逆I是堿性蛋白酶的主要識別酶切位點(diǎn)，多肽C-末端大部分是疏水性氨基酸，因此堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的苦味最大[30]。盡管風(fēng)味蛋白酶的水解度也很高，但是蛋白酶解物樣品中疏水性氨基酸和苦味氨基酸的比例最低，因?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶是內(nèi)切酶和外切酶的混合物，外切酶可有效地將大豆多肽端基的疏水性氨基酸切除，同時風(fēng)味蛋白酶添加的風(fēng)味物質(zhì)也有掩蓋苦味的作用[31]。

3 結(jié)論

(1)不同酶處理時，提油效果較好的是堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶，提油率均在90%左右。

(2)堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶及胰蛋白酶酶解樣品的溶解性分別為91.12%、84.09%、83.43%、79.2%、87.12%、89.4%及70.98%，所有酶解樣品中堿性蛋白酶處理的溶解性最好，風(fēng)味蛋白酶處理的溶解性與其相比差異較小。

(3)經(jīng)蛋白酶水解后，由于大豆蛋白大分子蛋白質(zhì)的降解，疏水基團(tuán)的暴露，蛋白質(zhì)溶解度的提高和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的增多，提高了蛋白質(zhì)的表面活性，因此具有更好的乳化活性。風(fēng)味蛋白酶酶解的樣品乳化性最好，乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)分別為185.06 m2/g和78.9 min；堿性蛋白酶酶解物的乳化性最差。

(4)通過感官評價、氨基酸組成分析、水解度和SDS-PAGE分析可知，風(fēng)味蛋白酶酶解物苦味值最低，這是由于風(fēng)味蛋白酶含有的外切酶可有效地將大豆多肽端基的疏水性氨基酸切除，達(dá)到降低苦味的目的，同時含有的風(fēng)味物質(zhì)也有掩蓋苦味的功效。該結(jié)果為風(fēng)味蛋白酶應(yīng)用于生物解離，在獲取較高提油率前提下，還能得到功能性良好、苦味值低的大豆蛋白酶解物提供了一定的理論依據(jù)。