張俊萍 魏 征

(河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

化瘀解毒方是河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院內(nèi)部制劑，臨床運(yùn)用治療肺癌多年，取得了良好的療效。本研究以人肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，探討化瘀解毒方抗肺癌的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 化瘀解毒方藥免煎顆粒劑杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)、胎牛血清，GIBCO，美國(guó)；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，Sigma，美國(guó)；青霉素、鏈霉素，晶美生物科技有限公司，中國(guó)；Matrigel 基底膜基質(zhì)膠(Becton，Dickinson and Company，美國(guó))；抗-蛋白激酶B(Akt)(#4691)，抗-3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)1(#5662)，抗-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)(#4225)，抗-磷酸化(p)Akt(#4058)，抗-p-PDK1(#3061)，抗-p-PI3K(#4228)和抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(#5174)，山羊抗兔IgG，Cell Signaling Technology，美國(guó))；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒(Thermo，美國(guó))；預(yù)染蛋白Marker(Fermentas，美國(guó))；聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)移膜(Millipore，美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 醫(yī)用X光膠片(Fujifilm，日本)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó))，酶標(biāo)儀(Bio-Rad，USA)，TY-80B 脫色搖床(武漢格萊莫檢測(cè)設(shè)備有限公司，中國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))，X光洗片機(jī)(江蘇省泰興市泰龍醫(yī)用設(shè)備廠，中國(guó))。Transwell 板(Costar，美國(guó))，實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增儀(ABI，美國(guó))，核酸定量?jī)x(Thermo，美國(guó))。

1.3樣品準(zhǔn)備 按照復(fù)方中的比例，分別稱取半枝蓮61.00 g、廣木香19.52 g、雞內(nèi)金19.52 g、三七9.76 g、全蝎6.10 g、壁虎6.10 g。加8倍量水進(jìn)行回流提取，提取2次，合并提取液，濃縮，烘干至浸膏狀，冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干處理，得粉末，上述粉末粉碎過(guò)100目篩，細(xì)粉稱重。蒸餾水倍比稀釋成含生藥1 g/ml的水煎劑，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱備用。環(huán)磷酰胺(CTX)粉針劑：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，200 mg/支，與0.9%氯化鈉溶液配置制20 mg/ml的溶液，4℃冰箱保存。

1.4含藥血清制備 大耳白兔12只，隨機(jī)分為化瘀解毒方藥高劑量組、低劑量組、CTX組、生理鹽水組，每組3只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”〔1〕，化瘀解毒方藥高、低劑量組分別用每天15、30 g/kg劑量口服灌胃；生理鹽水組給予相同劑量的生理鹽水1次/d，連灌1 w；CTX組第1天予20 mg/kg腹腔注射，后6 d給予等劑量生理鹽水灌胃。于末次給藥后1 h，無(wú)菌條件下心臟采血，分離血清，56℃、30 min下補(bǔ)體滅活，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細(xì)胞培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。在37℃、5% CO2條件下，于含100 U/ml 青霉素、100 U/ml鏈霉素和10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.6細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔4×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng) 24 h后，分別加入生理鹽水組、化瘀解毒方藥高、低劑量組、CTX組的含藥血清，空白對(duì)照組加入等體積的胎牛血清，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12～72 h后，每孔加入10 μl MTT(4 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入200 μl DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在 570 nm 處測(cè)定吸光度值(OD570)，計(jì)算抑制率。公式：抑制率(%)=(1-給藥組OD570/空白對(duì)照組OD570)×100%。

1.7細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 96孔板底部孵育5 mg/ml matrigel，每孔200 μl，4℃過(guò)夜待用。取不同對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，計(jì)數(shù)，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔4×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng) 24 h后，以不同濃度的化瘀解毒方提取物處理不同時(shí)間。在96孔板中孵育3 h后，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍去除未貼壁的細(xì)胞。每孔加入 5 mg/ml MTT，每孔10 μl，37℃孵育4 h。去除上清液，每孔加入200 μl DMSO 溶解結(jié)晶，570 nm處檢測(cè)吸光度。計(jì)算黏附細(xì)胞百分比。

1.8細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 采用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞遷移。在37℃下，Transwell板上腔下表面包被fibronectin(10 μg/ml)2 h待用。A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度化瘀解毒方提取物處理48 h后，混懸于無(wú)血清培養(yǎng)液中加入上腔。下腔加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液。24 h后用結(jié)晶紫染色檢測(cè)遷移至下表面的細(xì)胞數(shù)。顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，每組至少5個(gè)視野。計(jì)算遷移率，遷移率=給藥組/溶劑對(duì)照組×100%。

1.9細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 采用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞侵襲。Transwell板上腔加入5 mg/ml matrigel，每孔100 μl，37 ℃下孵育4 h待用。A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度化瘀解毒方提取物處理48 h后，處理的細(xì)胞混懸于無(wú)血清培養(yǎng)液中加入上腔。下腔加入含20%的胎牛血清培養(yǎng)液。24 h后，用結(jié)晶紫染色檢測(cè)侵襲至基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，每組至少5個(gè)視野。計(jì)算侵襲率，侵襲率=給藥組/溶劑對(duì)照組×100%。

1.10細(xì)胞總RNA提取 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，接種于6孔板中。24 h后，不同濃度化瘀解毒方提取物處理A549腫瘤細(xì)胞株12 h。棄6孔板中上清培養(yǎng)液，加入1 ml Trizol試劑反復(fù)吹打細(xì)胞后，加入200 μl氯仿?；靹?，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，加入同體積異丙醇，混勻，12 000 r/min離心10 min。沉淀用70% 乙醇洗1遍，加入無(wú)核酸酶的水溶解RNA。用核酸分析儀檢測(cè)RNA濃度及其質(zhì)量。

1.11RNA反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，接種于6孔板中。24 h后，A549細(xì)胞株經(jīng)不同濃度化瘀解毒方提取物處理，12 h后采用Trizol提取A549細(xì)胞總RNA。采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用Beacondesigner4.0軟件設(shè)計(jì)引物。擴(kuò)增條件：預(yù)變性50℃ 2 min；變性95℃ 10 min；延伸：95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，收集熒光信號(hào)，在該階段擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；第4步做溶解曲線。經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證，各個(gè)產(chǎn)物的擴(kuò)增效率以目標(biāo)基因與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的雙 Delta-C比值分析，計(jì)算各組的相對(duì)表達(dá)情況。

1.12免疫印跡分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，接種于6孔板中。24 h后，A549腫瘤細(xì)胞株經(jīng)不同濃度化瘀解毒方提取物處理12 h后棄6孔板中上清液，用冰浴的PBS洗滌，在冰上用組織細(xì)胞快速裂解液(RIPA)緩沖液抽提。離心取細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白定量，上樣緩沖液煮樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后采用半干法轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含有5%奶粉的Tris緩沖鹽溶液(TBS)封閉過(guò)夜，添加一抗37℃孵育4 h，TBST(含Tween-20的TBS)洗膜，二抗孵育1 h，TBS洗滌之后電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，洗片。選用GAPDH作為內(nèi)參，1∶400稀釋。

1.13數(shù)據(jù)處理和分析 采用SPSS20.0軟件行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1化瘀解毒方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 終濃度為5%、10%和20%的化瘀解毒方含藥血清作用48 h劑量依賴性抑制A549腫瘤細(xì)胞增殖。其中低劑量組抑制率分別為29%、46%和64%，高劑量組為42%、61%和82%。結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)代謝后的化瘀解毒方含藥血清可以有效抑制A549腫瘤細(xì)胞增殖，具有較好的抗腫瘤作用。見(jiàn)圖1。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇化瘀解毒方含藥血清的終濃度為10%，作用為48 h。

圖1 化瘀解毒方含藥血清劑量依賴性抑制A549腫瘤細(xì)胞增殖

2.2化瘀解毒方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞黏附的影響 低劑量和高劑量的化瘀解毒方含藥血清均可抑制A549腫瘤細(xì)胞的黏附能力。其中，生理鹽水組含藥血清處理過(guò)的A549細(xì)胞中39%具有黏附能力，而經(jīng)過(guò)低劑量化瘀解毒方含藥血清處理48 h的A549細(xì)胞23%黏附至底板。而高劑量化瘀解毒方含藥血清處理48 h的A549細(xì)胞的黏附能力與CTX組大致相同，均為15%黏附至底板。結(jié)果說(shuō)明，化瘀解毒方含藥血清可以較強(qiáng)地抑制A549細(xì)胞黏附。

2.3化瘀解毒方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響 在相同放大倍數(shù)的視野下，71個(gè)生理鹽水組血清處理的細(xì)胞遷移至腔室下表面。低、高劑量含藥血清組和CTX組均能顯著抑制A549細(xì)胞遷移，遷移至腔室下表面的細(xì)胞數(shù)分別為41、18和23。說(shuō)明化瘀解毒方含藥血清可以抑制A549腫瘤細(xì)胞的遷移。見(jiàn)圖2。

圖2 化瘀解毒方含藥血清抑制A549細(xì)胞遷移(×100)

2.4化瘀解毒方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響 相同倍數(shù)放大視野下，45個(gè)生理鹽水組血清處理的細(xì)胞侵襲至基質(zhì)中。然而，低、高劑量含藥血清組和CTX組均能顯著抑制A549細(xì)胞侵襲，侵襲至基質(zhì)中的細(xì)胞數(shù)分別為28、15和14。說(shuō)明化瘀解毒方含藥血清可以抑制A549腫瘤細(xì)胞的侵襲。見(jiàn)圖3。

圖3 化瘀解毒方含藥血清抑制A549細(xì)胞侵襲(×100)

2.5化瘀解毒方含藥血清對(duì)細(xì)胞中Akt通路的影響 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，化瘀解毒方含藥血清不影響A549細(xì)胞中PI3K，PDK1和Akt mRNA的表達(dá)，說(shuō)明化瘀解毒含藥血清不能通過(guò)抑制Akt信號(hào)通路中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖4。免疫印跡結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果一致，化瘀解毒方含藥血清和CTX對(duì)PI3K、PDK1和Akt蛋白水平無(wú)影響；然而，化瘀解毒方含藥血清顯著抑制A549細(xì)胞中Akt蛋白的磷酸化水平，說(shuō)明化瘀解毒方含藥血清抑制A549細(xì)胞增殖、黏附、遷移和侵襲與抑制Akt蛋白的磷酸化有關(guān)。見(jiàn)圖5。

圖4 化瘀解毒方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞中PI3K,|PDK1和Akt mRNA表達(dá)的影響

圖5 化瘀解毒方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞中Akt通路蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

在中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中，雖無(wú)肺癌的病名，但對(duì)其體征和癥狀卻早有載錄。如《靈樞·脹論》謂“肺脹者，虛滿而喘咳”?！端貑?wèn)·玉機(jī)真藏論篇》謂：“大骨枯槁，大肉陷下，胸中氣滿，喘息不便，內(nèi)痛引肩項(xiàng)，身熱脫肉破”?！稏|醫(yī)寶鑒》曰：“癰疽發(fā)于內(nèi)者，當(dāng)審臟腑，如中府隱隱而痛者，肺疽也”，以“疽”字論定了肺癌的惡變性質(zhì)。肺癌屬中醫(yī)的“咳嗽”、“咯血”、“胸痛”等范疇，古又有“肺積”、“痞癖”、“息賁”、“肺壅”之稱〔2〕。古代醫(yī)家對(duì)肺癌的病機(jī)分為正虛、邪實(shí)兩個(gè)方面〔3〕。《醫(yī)宗必讀》所言：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”?！动兛菩牡眉分刑岬健鞍┝稣?，非陰陽(yáng)正氣所結(jié)腫，乃五臟瘀血、濁氣痰滯而成”?，F(xiàn)代醫(yī)家對(duì)肺癌的病因病機(jī)認(rèn)識(shí)的側(cè)重點(diǎn)不同，但也分為正虛、邪實(shí)兩個(gè)方面。雖歷代醫(yī)家沒(méi)有明確提出瘀毒之名，但從“癥積”“噎嗝”“石瘕”“巖證”等病的病因、病理、證候特點(diǎn)、治療預(yù)后等方面的描述，論述了“瘀毒”的部分內(nèi)容。筆者認(rèn)為，肺癌是以“瘀毒”為標(biāo)、“元?dú)馓澨摗睘楸荆瑢⒎伟┑闹嗅t(yī)證候、病因病機(jī)概括為“瘀毒”〔4〕。肺癌瘀毒是由于元?dú)馑?，不能行血運(yùn)津，復(fù)因情志、外感、飲食、勞倦等因素，形成頑痰、死血，痰血積久不去，化火成毒所致。瘀與癌毒往往相伴而生，兩者具有同源互生的關(guān)系，形成癌毒的環(huán)境條件，同樣也是促成血瘀形成的環(huán)境條件，在血瘀的狀態(tài)下，癌毒更易形成，癌毒與血瘀等邪氣共同作用癌瘤更易發(fā)生，癌毒和癌瘤的存在又可進(jìn)一步加重血瘀的發(fā)展和變化。因而，肺內(nèi)癌毒一旦形成，不僅阻隔經(jīng)絡(luò)氣血，且掠奪水谷精微以自養(yǎng)，導(dǎo)致五臟六腑失卻氣血津液濡潤(rùn)，逐漸衰竭，而出現(xiàn)咳喘、痰中帶血、胸悶胸痛、氣短、消瘦乏力等癥?；鼋舛痉接扇⒈诨?、三七、半枝蓮、廣木香、雞內(nèi)金組成。其中全蝎、壁虎活血解毒為君；輔以三七活血化痰、軟堅(jiān)散結(jié)；佐以半枝蓮解毒抗癌，使以廣木香理氣和胃、疏暢氣血。諸藥合用，共奏活血解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、扶正抗癌之功。臨床治療癥瘕痞塊積證，常選用搜剔破瘀之力較強(qiáng)的蟲(chóng)類藥，以達(dá)到破瘀血、消積塊的目的。

PI3K的活性與多種人類腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。PI3K/Akt通路關(guān)鍵分子的抑制可以誘導(dǎo)其細(xì)胞周期阻滯，周期相關(guān)蛋白表達(dá)降低，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：化瘀解毒方提取物呈濃度依賴性抑制體外人肺癌A549腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。雖然化瘀解毒方含藥血清對(duì)PI3K，PDK1和Akt總蛋白水平無(wú)影響，但顯著抑制A549細(xì)胞中Akt蛋白的磷酸化水平。因此，考慮化瘀解毒方的作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt通路有關(guān)，但需要進(jìn)一步探索。