張海鵬 高麗娜 隋 雨 張凱峰 劉超英

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科，吉林 長(zhǎng)春 130000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%，而肺腺癌占NSCLC的50%〔1～3〕。肺癌的診斷率逐年提高，但肺癌患者的5年生存率卻未見(jiàn)顯著提高〔3〕，原因之一是肺癌對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐藥越來(lái)越嚴(yán)重〔4〕。故尋求新的通路來(lái)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞壞死迫在眉睫。而程序性壞死的出現(xiàn)〔5～7〕，為肺癌的治療開(kāi)辟了新的窗口，程序性壞死以形成受體相互作用蛋白酶(RIP)1和RIP3組成的壞死體為核心來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死〔8，9〕。紫草素(shikonin)是提取于紫草根部的萘醌類(lèi)化合物〔10〕。研究證實(shí)紫草素具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性壞死作用〔8，11～14〕，但紫草素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的作用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究探討紫草素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的作用并闡明其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 紫草素，RIP1的特異性抑制劑Nec-1(necrostatin-1)和抗氧化抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)(N-acetyl-L-cysteine)購(gòu)自Sigma公司。 RIP3的特異性抑制劑GSK(GSK-872)購(gòu)自Calbiochem公司。將紫草素溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，使其儲(chǔ)存濃度為50 mmol/L。抗RIP1抗體、抗RIP3抗體和抗(MLKL)抗體購(gòu)自Abcam公司。 β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。 其他試劑購(gòu)自Sigma公司，Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2細(xì)胞來(lái)源 人肺腺癌細(xì)胞(A549)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所(中國(guó)上海)。

1.3細(xì)胞系和細(xì)胞活力測(cè)定 將A549在補(bǔ)充有10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37℃和5%CO2潮濕環(huán)境中維持。 實(shí)驗(yàn)中使用對(duì)數(shù)中期的細(xì)胞。將A549(7×104個(gè)細(xì)胞/孔)接種于96孔微量培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h，然后用10 μmol/L的紫草素處理24 h。 使用MTT法測(cè)定570 nm吸光度，細(xì)胞存活力=A549細(xì)胞吸光度/對(duì)照組細(xì)胞吸光度。

1.4通過(guò)Annexin V/碘化丙啶(PI)檢測(cè)細(xì)胞死亡方式 細(xì)胞死亡方式的探尋是以Annexin V/PI 雙染色法為基礎(chǔ)的〔15〕。收集不同濃度紫草素處理24 h的A549。 然后，用Annexin V-FITC試劑盒評(píng)估細(xì)胞死亡形式。 將收集的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，重懸于400 ml 1×結(jié)合緩沖液(10 mmol/L HEPES/NaOH，140 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L CaCl2，pH7.4)。將細(xì)胞(100 μl)轉(zhuǎn)移至含有5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI的5 ml培養(yǎng)管中，然后在室溫下避光孵育15 min。每個(gè)管中加入1×結(jié)合緩沖液后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析染色的細(xì)胞。 使用CELLquest軟件分析細(xì)胞死亡率。 通過(guò)每管收集20 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，并確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)量。

1.5Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 用刮刀收集后通過(guò)離心收集A549在4℃以1 000 r/min離心10 min以獲得上清液。 使用Bio-Rad蛋白質(zhì)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。將等量的蛋白質(zhì)在10%聚丙烯酰胺(SDS)凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Billerica，MA，USA)。 在室溫下用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中的3%牛血清白蛋白封閉膜30 min，然后在4℃用抗RIP1(1∶1 000)、抗RIP3(1∶1 000)、抗MLKL(1∶1 000)抗體、抗β-actin(1∶1 500)抗體孵育。與辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG(1∶2 000)孵育后，洗滌印跡，并在具有增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的Kodak X-omat LS膜(Eastman Kodak Company，NewHaven，CT)上顯現(xiàn)免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)(Amersham Biosciences，Piscataway NJ)。使用柯達(dá)ID圖像分析軟件進(jìn)行密度測(cè)量。

1.6測(cè)量細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS) 將A549細(xì)胞(7×104個(gè)/孔)接種于96孔微量培養(yǎng)板上并培養(yǎng)24 h，然后用目標(biāo)化合物處理24 h。 使用氧化還原敏感染料2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS水平。 將所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在PBS中洗滌兩次，并用20 mmol/L DCFH-DA在黑暗中染色30 min。細(xì)胞用1%Triton X-100溶解后，在485 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量熒光，使用熒光光譜儀(HTS7000，Perkin Elmer，Boston，MA)的發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。ROS水平以對(duì)照的百分比表示。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0進(jìn)行One-way ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1紫草素對(duì)A549細(xì)胞活性抑制 相比于對(duì)照組(0 μmol/L)，用紫草素處理的A549細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.001),2、4、8、16 μmol/L的紫草素作用24 h后，肺腺癌A549細(xì)胞的生存率分別為(94.84±2.08)%、(87.98±1.93)%、(62.79±2.46)%、(26.36±2.83)%；紫草素濃度梯度下RIP1和RIP3蛋白水平變化見(jiàn)圖1；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫草素抑制A549細(xì)胞活性與濃度有關(guān)?；谝陨蠑?shù)據(jù)，確定的紫草素半數(shù)致死量濃度(IC50)為10.5 μmol/L。選擇10 μmol/L為藥物濃度。

圖1 0、10 μmol/L紫草素作用后A549細(xì)胞變化

2.2紫草素以壞死的方式誘導(dǎo)A549細(xì)胞死亡 紫草素預(yù)先處理A549細(xì)胞，然后經(jīng)Annexin V/PI 雙染色法染色，最后流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果為：活細(xì)胞(即Annexin V-/PI-)的數(shù)量明顯下降(P<0.001)；凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)未見(jiàn)明顯變化(P=0.178)；但表現(xiàn)為Annexin V+/PI+和Annexin V-/PI+的壞死細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增加(P<0.001)(圖2)。與對(duì)照組(死亡率為0)相比，單加Nec-1組中肺腺癌A549細(xì)胞活性未見(jiàn)明顯變化，細(xì)胞死亡率為3.00%±0.64%；而在5 μmol/L紫草素組，該細(xì)胞活性受到抑制，細(xì)胞死亡率為24.72%±2.50%，而同時(shí)用150 μmol/L Nec-1預(yù)處理后的5 μmol/L紫草素組中，上述細(xì)胞的活性恢復(fù)，細(xì)胞死亡率為15.25%±2.77%；10 μmol/L紫草素組細(xì)胞的死亡率為76.34%±2.76%；而在150 μmol/L Nec-1預(yù)處理后，10 μmol/L紫草素組的細(xì)胞死亡率為65.51%±0.78%。與對(duì)照組(死亡率為0)相比，單加Gsk組中肺腺癌A549細(xì)胞活性未見(jiàn)明顯變化，細(xì)胞死亡率為2.96%±0.32%；而在5 μmol/L紫草素組，該細(xì)胞活性受到抑制，細(xì)胞死亡率為25.35%±1.39%，150 μmol/L Gsk預(yù)處理后的5 μmol/L紫草素組中，上述細(xì)胞的活性恢復(fù)，細(xì)胞死亡率為16.44%±1.87%；10 μmol/L紫草素組細(xì)胞的死亡率為76.62%±0.77%；而在150 μmol/L Gsk預(yù)處理后的10 μmol/L紫草素組細(xì)胞死亡率為65.86%±1.46%。

圖2 紫草素濃度梯度下肺腺癌細(xì)胞RIP1、RIP3蛋白表達(dá)

2.3紫草素作用下A549細(xì)胞中RIP1和RIP3高表達(dá) A549細(xì)胞死亡與RIP1和RIP3表達(dá)增加相關(guān)。蛋白電泳顯示，紫草素預(yù)加工后的A549細(xì)胞中，RIP1和RIP3表達(dá)量顯著提高(圖3)。但應(yīng)用Nec-1(150 μmol/L)預(yù)處理肺腺癌A549細(xì)胞，MTT法表明實(shí)驗(yàn)組中Nec-1明顯地解除了紫草素對(duì)于肺腺癌A549的活性抑制，且蛋白電泳也支持上述結(jié)果。GSK(5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞后，也得到類(lèi)似的結(jié)果(圖3)。

2.4紫草素通過(guò)RIP1/RIP3來(lái)影響A549細(xì)胞ROS水平 使用DCFH-DA作為探針來(lái)檢測(cè)紫草素處理后A549細(xì)胞ROS水平較對(duì)照明顯升高(P<0.001)。應(yīng)用NAC后，A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降顯著(P<0.001)。同樣使用Nec-1及GSK后也具有相近結(jié)果(圖4)。無(wú)論單獨(dú)應(yīng)用Nec-1、GSK或NAC后，A549細(xì)胞中ROS較對(duì)照組均無(wú)明顯變化(均為1)；而在5 μmol/L紫草素處理后ROS水平升高，為150.44±3.469 4，同時(shí)Nec-1、GSK及NAC處理后ROS濃度明顯升高，分別為133.33±3.511 9、135.00±4.582 6和130.67±7.767 5；10 μmol/L紫草素處理后ROS水平升高，為231.67±2.081 7，同時(shí)Nec-1、GSK及NAC處理后ROS濃度明顯升高，分別為197.00±3.000 0、213.00±1.732 0和183.67±2.516 6?；旌献V系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(MLKL)參與ROS產(chǎn)生中，故MLKL蛋白水平變化隨ROS變化。故RIP1和RIP3與ROS表達(dá)有關(guān)(圖4)。

圖3 紫草素對(duì)A549細(xì)胞RIP1、RIP3蛋白表達(dá)的影響

圖4 紫草素通過(guò)RIP1/RIP3來(lái)影響A549細(xì)胞MLKL、RIP1、RIP3蛋白表達(dá)水平

3 討 論

Huang等〔8〕認(rèn)為紫草素使RIP1表達(dá)量升高而使膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡。Chen等〔12〕考慮紫草素誘導(dǎo)的RIP3變化在胰腺癌細(xì)胞的程序性壞死中發(fā)揮主要的作用。Fu等〔11〕證明紫草素致使結(jié)直腸癌細(xì)胞依賴(lài)RIP1和RIP3發(fā)生程序性壞死。

本研究表明：紫草素對(duì)于A549細(xì)胞具有殺傷作用，且與紫草素濃度有關(guān)，隨著其濃度升高，RIP1和RIP3的表達(dá)量增多。但其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡機(jī)制尚有爭(zhēng)議。Chen等〔12〕認(rèn)為凋亡是紫草素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞死亡的方式；而在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及結(jié)直腸癌細(xì)胞里則主要以程序性壞死方式死亡〔8，11〕。這意味著紫草素可能通過(guò)不同的途徑在不同的腫瘤細(xì)胞中起作用。本文結(jié)果表明，A549細(xì)胞是以壞死為主要死亡形式；這與之前的報(bào)道一致〔13〕。

本文結(jié)果表明，程序性壞死的特異性抑制劑解除了紫草素的抑制作用，這一證據(jù)也支持紫草素誘導(dǎo)的壞死為程序性壞死。同時(shí)結(jié)合程序性壞死的特點(diǎn)：①形成由RIP1和RIP3組成的壞死體〔9〕；②壞死是其主要的形態(tài)學(xué)特征〔8〕，可見(jiàn)紫草素作用下的A549細(xì)胞發(fā)生了程序性壞死。

雖然RIP1和RIP3參與程序性壞死，但其下游信號(hào)仍然不清楚。Kim等〔13〕認(rèn)為抑制自噬可以增強(qiáng)紫草素對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用，故自噬也可能是程序性壞死的下游通路。研究證明RIP1和RIP3均與ROS的產(chǎn)生相關(guān)〔16，17〕。而MLKL能夠調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體的功能參與ROS 的表達(dá)〔18〕。本文結(jié)果證實(shí)紫草素誘導(dǎo)RIP1和RIP3表達(dá)量升高導(dǎo)致A549細(xì)胞內(nèi)ROS異常表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

綜上，紫草素具有殺傷肺腺癌細(xì)胞的作用，且RIP1和RIP3可視為肺腺癌的靶向蛋白之一，這為肺腺癌的治療提供了新的理論依據(jù)。