朱海濤，呂進(jìn)泉，王秋霞，相虹

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212000)

過敏性紫癜(HSP)是一種兒童常見的血管變態(tài)性出血性疾病，臨床表現(xiàn)主要為非血小板減少性紫癜、關(guān)節(jié)腫痛、腹痛及腎臟損傷(以蛋白尿或血尿?yàn)橹?[1]。紫癜性腎炎(HSPN)是HSP的常見并發(fā)癥，嚴(yán)重影響HSP的病程及預(yù)后[2]。目前HSP的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，免疫功能紊亂、體液免疫異常導(dǎo)致大量免疫球蛋白(Ig)A的沉積是HSP重要致病因素這一論點(diǎn)普遍為學(xué)者所接受[3]。HSP 患者的細(xì)胞免疫功能紊亂主要表現(xiàn)在急性期外周血中T淋巴細(xì)胞亞群異常，CD4+T/CD8+T 比值下降(即CD4+T細(xì)胞數(shù)量降低，CD8+T細(xì)胞數(shù)量增高)，其中Th1/Th2 免疫應(yīng)答失衡，即Th1功能降低，Th2優(yōu)勢活化[4]。Toll 樣受體(TLRs)可通過識別病原微生物表面上各種不同的病原模式相關(guān)分子，激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路級聯(lián)反應(yīng)，最終產(chǎn)生一系列炎癥細(xì)胞因子[5]。TLRs的激活誘導(dǎo)了Th1型適應(yīng)性免疫應(yīng)答, 在這一過程中產(chǎn)生干擾素 (IFN-γ)的CD4+T細(xì)胞占優(yōu)勢。TLR的激活誘導(dǎo)如白細(xì)胞介素12(IL-12)、IL-23和IL-27等細(xì)胞因子的表達(dá), 促使未成熟前體細(xì)胞Th0向Th1細(xì)胞分化, 并且抑制Th2細(xì)胞分化, 在向Th2細(xì)胞分化過程中分泌IL-4、IL-5和IL-13, 但不分泌IFN-γ[6，7]。TLR2受體在Toll樣受體家族中表達(dá)范圍最廣，是識別病原微生物種類最多的成員，它可觸發(fā)機(jī)體對致病微生物的級聯(lián)免疫應(yīng)答，已經(jīng)成為多種疾病治療的新靶點(diǎn)[8]。本研究觀察了HSP患兒外周血TLR2的表達(dá)變化，并分析其在Th1/Th2免疫應(yīng)答過程中的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年3月～2017年11月間于我院住院治療的71例HSP患兒，其中男40例、女31例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2006年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)和歐洲兒科風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(PReS)制定HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。②首次發(fā)病且患兒年齡≤14歲。③近1個(gè)月內(nèi)未接受過任何肝素、糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制劑類藥物的治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往或目前患有原發(fā)性腎臟疾病，如腎病綜合征、Ig A 腎病、腎小球腎炎等。②存在如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病引起的腎臟損害。③有血小板減少性紫癜，血友病、白血病等血液系統(tǒng)疾病。根據(jù)2009年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟病學(xué)組的紫癜性腎炎的診治循證指南(試行)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，將71例患兒分為無腎損害者(NHSPN)及有腎損害者(HSPN)。NHSPN35例中男19例，女16例；年齡4～13(6.56 2.26)歲。HSPN36例中男21例，女15例；年齡3～13(5.98 2.98)歲。另選同期在我院志愿參加研究的35例健康兒童作為對照組，男20例，女15例；年齡3～13(5.66 2.53)歲。三組患兒在性別、年齡上差異具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論通過，所有納入者均征得家屬知情同意。

1.2 外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中TLR2 mRNA檢測方法 收集納入者靜脈血3 mL，無菌肝素抗凝，無菌狀態(tài)下密度梯度離心，得到PBMC。采用RT-PCR法檢測PBMC中TLR2 mRNA：TRIzol提取RNA，測定RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)檢測目的基因TLR2的mRNA(以GADPH作為內(nèi)參蛋白),以2-△△Ct代表TLR2 mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 外周血CD14+單核細(xì)胞表面TLR2蛋白檢測方法 收集納入者靜脈血3 mL，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD14+單核細(xì)胞表面TLR2蛋白：分別取100 L外周靜脈血，加入5 L CD14-FITC抗體，測試管加入5 L TLR2-PE抗體，對照管中加入5 L PE標(biāo)記的Mouse IgG2 抗體，37 ℃避光孵育15 min，加入3 mL溶血素混勻，靜置15 min后1 500 rpm離心5 min，PBS洗滌2次，300 L PBS重懸，Cytomics FC500 型流式細(xì)胞儀上檢測TLR2陽性細(xì)胞所占比例。

1.4 外周血IFN-γ、IL-4檢測方法 抽取納入者空腹靜脈血3 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附法測量血清IFN-γ、IL-4。按照IL-4試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)和IFN-γ試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)說明書的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別在450 nm處讀取待測物的光密度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到每個(gè)待測樣品血清中IFN-γ、IL-4含量。

2 結(jié)果

HSPN、NHSPN及對照組PBMCs 中TLR2 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.97±0.76、1.50±0.70、1.11±0.52，兩兩比較,P均<0.05。HSPN、NHSPN及對照組外周血CD14+單核細(xì)胞表面TLR2蛋白含量分別為0.44±0.29、0.19±0.12、0.09±0.06，兩兩比較,P均<0.05。三組血清IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較見表1。

表1 三組受血清IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與NHSPN相比，#P<0.05。 HSP患兒CD14+單核細(xì)胞表面TLR2蛋白蛋白表達(dá)與血清IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.906,P=0.000)；與IL-4水平呈正相關(guān)(r=0.994，P=0.000)。

3 討論

HSP是一種以全身小血管炎癥為主要病變的臨床綜合征，20%以上的HSP患兒都伴隨著腎損傷的發(fā)生[11]。目前HSP的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前公認(rèn)的主要發(fā)病機(jī)制包括T淋巴細(xì)胞功能失調(diào)、體液免疫異常和細(xì)胞因子分泌異常的免疫功能紊亂。除此之外，炎癥介質(zhì)、凝血與纖溶機(jī)制等多方面因素可能共同參與了HSP的發(fā)病發(fā)展過程。HSP病情的發(fā)展與T淋巴細(xì)胞的免疫功能紊亂緊密相關(guān)。成熟的T淋巴細(xì)胞包括CD4+、CD8+兩個(gè)細(xì)胞亞群。研究[12]發(fā)現(xiàn)，HSP患兒體內(nèi)外周血中細(xì)胞因子微環(huán)境發(fā)生變化后導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞數(shù)量降低，而CD8+T細(xì)胞數(shù)量增高，CD4+/CD8+比值明顯降低，表明CD4+/ CD8+T細(xì)胞比例失衡可能是參與HSP發(fā)病的因素之一。將CD4+T淋巴細(xì)胞按照分泌的細(xì)胞因子及其功能的不同，分為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)四個(gè)亞群。正常情況下Th1和Th2之間動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)使得機(jī)體免疫處于動(dòng)態(tài)平衡。如果這種平衡遭受破壞，就可能會(huì)導(dǎo)致免疫功能調(diào)節(jié)紊亂，進(jìn)而引起疾病。Th1細(xì)胞可分泌IFN-γ、IFN-γ及IL-12等細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞經(jīng)IFN-γ刺激后會(huì)釋放大量IL-12，刺激其他Th0細(xì)胞向Th1型分化，并抑制其向Th2型分化，構(gòu)成正反饋通路。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等與抗體產(chǎn)生和抑制的細(xì)胞因子。IL-4一方面通過誘導(dǎo)B細(xì)胞表面抗原CD23的表達(dá)來促進(jìn)B細(xì)胞的活化并促進(jìn)IgE等合成過程、下調(diào)IFN-γ的分泌，使得機(jī)體處于慢性持續(xù)性炎癥的狀態(tài)。另一方面IL-4可通過抑制Th1細(xì)胞的活化，從而促使Th0細(xì)胞分化成Th2型，進(jìn)而Th2繼續(xù)大量分泌IL-4，形成正反饋調(diào)劑機(jī)制，促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生[13]。故IL-4是將體液免疫和細(xì)胞免疫聯(lián)系起來的細(xì)胞因子。而B淋巴細(xì)胞的活化，可促進(jìn)B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白向IgA轉(zhuǎn)化，從而患兒體內(nèi)IgA水平增高。進(jìn)一步地，IgA和IgA免疫復(fù)合物逐漸沉積在小血管中，從而損傷血管內(nèi)皮引起炎癥反應(yīng)，從而加重HSP的疾病進(jìn)展[14，15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSP患兒PBMCs中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值低于對照組，IL-4水平高于對照組，且HSPN組中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值顯著低于NHSPN組，IL-4水平顯著高于NHSPN組，說明HSP患兒存在Thl /Th2免疫失衡和Th2過度活化的現(xiàn)象，Th2活化可能與腎損傷緊密相關(guān)。

TLRs是一種Ⅰ型跨膜蛋白，可識別內(nèi)源性或外源性配體，通過信號傳導(dǎo)途徑分別激活轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子、趨化因子基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)傳導(dǎo)途徑異?；罨瘯r(shí)，可干擾機(jī)體自身免疫機(jī)制，導(dǎo)致免疫功能紊亂[16]。TLRs在調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡中的作用：一方面，TLRs通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與MyD88蛋白共同參與Thl/Th2的調(diào)節(jié)反應(yīng)。有研究[17]表明，用脂多糖(LPS)刺激去除小鼠樹突狀細(xì)胞的MyD88蛋白后可誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌IL-4而不能分泌IL-12和IFN-γ，即表現(xiàn)為Th1反應(yīng)缺陷；另一方面，TLRs通過配體參與Th1/Th2的調(diào)節(jié)反應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)TLR2與配體結(jié)合后可誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子分泌IL-4，導(dǎo)致Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)[18]。Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)，TLR2、TLR4可在炎癥模型中誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)。

本研究結(jié)果，與對照組比較，HSP患兒PBMCs中的TLR2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高，HSPN TLR2的基因及蛋白表達(dá)顯著高于NHSPN。結(jié)果提示HSP患兒中TLR2表達(dá)水平顯著增加，且有腎損傷的HSP會(huì)伴隨著TLR2的過度激活。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)HSP患兒PBMC中的TLR2蛋白表達(dá)與血清IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)，與IL-4水平呈正相關(guān)。說明HSP患兒中TLR2可能參與到Thl/Th2的調(diào)節(jié)反應(yīng)中，參與IFN-γ和IL-4的分泌調(diào)節(jié)并使Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)上調(diào)。

綜上所述， HSP患兒外周血PBMCs 中TLR2表達(dá)升高，且HSPN患兒外周血PBMCs 中TLR2表達(dá)升高更明顯。TLR2可能通過降低IFN-γ水平、升高IL-4水平參與HSP的腎損傷。