劉國(guó)艷，徐 鑫，劉 莉，張 潔，莊林武，金青哲，王興國(guó)，張 暉,*

茶葉籽油作為一種新興的可食用植物油脂，不飽和脂肪酸含量達(dá)80%以上，其中多不飽和脂肪酸含量約25%左右，是大多數(shù)植物油的2 倍[1-3]。油脂的不飽和程度與氧化酸敗呈正相關(guān)，但茶葉籽油在常溫條件下保存1～2 a后品質(zhì)良好，氧化穩(wěn)定性較高[4-5]，這應(yīng)與其中酚類、甾醇、角鯊烯、VE等天然抗氧化活性成分有關(guān)[6-7]。茶葉籽油中酚類物質(zhì)主要包括沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、咖啡酸、沒(méi)食子酸酯、山柰酚、肉桂酸、槲皮素、沒(méi)食子酸、咖啡酸、蘆丁、槲皮素等[8-10]。酚類物質(zhì)和VE均具有較強(qiáng)的抗氧化效果[11-12]，但二者之間在不同含量和結(jié)構(gòu)組成時(shí)可能存在多種抗氧化相互作用類型，在茶葉籽油中天然存在的這兩類物質(zhì)的抗氧化能力和相互作用關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。由于多數(shù)食用植物油中源于次生代謝的活性物質(zhì)含量豐富且種類繁多，在一般的植物油體系中，研究上述物質(zhì)對(duì)脂肪酸組成復(fù)雜的植物油氧化穩(wěn)定性的影響及相互作用關(guān)系存在諸多困難。而豬油的脂肪酸組成相對(duì)簡(jiǎn)單，且自身存在的抗氧化成分極少，本研究以其作為參考體系，模擬茶葉籽油自身所含有的酚類物質(zhì)和VE在油脂加速氧化過(guò)程中的抗氧化能力及相互作用關(guān)系，避免因復(fù)雜的脂肪酸組成及其他抗氧化活性物質(zhì)帶來(lái)的干擾，旨在研明富含不飽和脂肪酸的茶葉籽油具有強(qiáng)氧化穩(wěn)定性的機(jī)理，為茶葉籽油適度精煉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉籽 云南隨縣洪山鎮(zhèn)云霧山茶場(chǎng)；豬板油市售。

VE（α-生育酚，純度＞96%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所；異丙醇、正己烷、甲醇、石油醚、冰醋酸（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；UV 1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 天美科技有限公司；EYELA MG-2200氮吹儀、EYELA N-1200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀東京理化器械株式會(huì)社；FW 100高速粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；D2F-6020真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉籽油制備

茶葉籽烘干后粉碎，加入正己烷，料液比為1∶10（g/mL），采用超聲波輔助提取法，超聲功率280 W，20 min后45 ℃水浴攪拌，提取1.5 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。

1.3.2 豬油制備

稱取一定量的豬板油，清洗干凈后于絞肉機(jī)中攪碎，置于燒杯中按料液比1∶4（g/mL）加水混勻，于90 ℃水浴20 min，8 000 r/min離心30 min，取上層豬油樣品。

1.3.3 茶葉籽油酚類物質(zhì)的制備

稱取1 kg茶葉籽油于10 L反應(yīng)釜中，加異丙醇（料液比1∶1（g/mL）），300 r/min混勻，加甲醇（料液比1∶5（g/mL）），混勻，于50 ℃水浴萃取30 min，混勻，靜置1 h，從反應(yīng)釜放料口排去下層，將上清液50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 L，按照上述步驟重復(fù)萃取3 次，合并3 次上清液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。

脫脂處理：取上述樣品10 g，用甲醇定容至150 mL，再加入300 mL的正己烷脫脂，靜置30 min，取下層，萃取3 次，合并3 次萃取液，50 ℃旋干。按照上述方法多次制備并混勻，測(cè)定其總酚含量。

1.3.4 常溫氧化實(shí)驗(yàn)

稱取300 g茶葉籽油于封口透明錐形瓶，置于室溫避光貯藏12 個(gè)月，每隔30 d測(cè)一次油樣的過(guò)氧化值和酸值，以過(guò)氧化值和酸值上升速率來(lái)衡量茶葉籽油的貯藏穩(wěn)定性。

1.3.5 恒溫加速氧化實(shí)驗(yàn)

采用Schaal法（63±1）℃烘箱加速氧化，對(duì)不同組的油樣進(jìn)行為期一個(gè)月的油脂氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，每隔12 h攪拌1 次，每隔3 d取一次樣，每次取樣5.0 g，測(cè)定各氧化指標(biāo)及活性成分含量。

實(shí)驗(yàn)分5 組進(jìn)行，每組樣品具體如下：

茶葉籽油組：稱取400 g茶葉籽油于棕色錐形瓶，敞口避光置于烘箱；豬油組：稱取400 g豬油于棕色錐形瓶，敞口避光置于烘箱；豬油＋VE組：稱取400 g豬油＋VE（α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品）0.112 g于棕色錐形瓶，使得VE含量為382 mg/kg（依據(jù)茶葉籽油中VE實(shí)際含量），敞口避光置于烘箱；豬油＋酚類物質(zhì)組：稱取400 g豬油＋茶葉籽油酚類物質(zhì)于棕色錐形瓶，使得總酚含量為530 mg/kg（依據(jù)茶葉籽油中酚類物質(zhì)實(shí)際含量），敞口避光置于烘箱；豬油＋VE＋酚類物質(zhì)組：稱取400 g豬油＋茶葉籽油酚類物質(zhì)＋VE（α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品）0.112 g，于棕色錐形瓶，使得總酚和VE含量分別為530、382 mg/kg，敞口避光置于烘箱。

1.3.6 氧化指標(biāo)的測(cè)定

過(guò)氧化值：依據(jù)GB/T 5538—2005《動(dòng)植物油脂過(guò)氧化值測(cè)定》測(cè)定[13]；酸值：依據(jù)GB/T 5530—2005《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測(cè)定》測(cè)定[14]；茴香胺值：依據(jù)GB/T 24304—2009《動(dòng)植物油脂茴香胺值的測(cè)定》測(cè)定[15]；丙二醛含量：依據(jù)GB/T 5009.181—2003《豬油中丙二醛的測(cè)定》測(cè)定[16]。

1.3.7 活性成分測(cè)定

采用福林-酚法[17]測(cè)定總酚含量：1 g油樣（茶葉籽油或豬油）溶于1 mL異丙醇，加5 mL甲醇50 ℃浸提30 min，8 000 r/min離心5 min，重復(fù)萃取3 次，合并上清液，40 ℃條件下氮?dú)獯蹈?，?00%甲醇定容至5 mL后取1 mL與1 mL福林-酚試劑混合，加入3 mL 7.5% Na2CO3于室溫條件下靜置反應(yīng)1 h，于波長(zhǎng)765 nm測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

VE含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[18]，并略作修改。取1.0 g樣品油，精確至0.001 g，正己烷定容至10 mL，取VE混標(biāo)0.01 g定容至10 mL，進(jìn)行高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件：Waters Spherisorb Silica色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：正己烷-異丙醇（98.5∶1.5，V/V）溶液；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)295 nm。

1.3.8 酚類物質(zhì)與VE相互作用類型

根據(jù)過(guò)氧化值，確定誘導(dǎo)時(shí)間、傳播時(shí)間，進(jìn)而計(jì)算協(xié)同價(jià)，相關(guān)計(jì)算方法如下[19-23]：

誘導(dǎo)時(shí)間、傳播時(shí)間的計(jì)算：油脂氧化反應(yīng)在動(dòng)力學(xué)上屬于一級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)方程為：-dc/dt=kc，進(jìn)行積分推導(dǎo)得方程：lnc=-kt＋lnc0。其中c為過(guò)氧化值（mmol/kg），k為速率常數(shù)，c0為起始油樣的過(guò)氧化值（mmol/kg）。令y=lnc、x=t，進(jìn)行回歸計(jì)算，即可得到（63±1）℃條件下各油樣的回歸方程。作圖法確定空白組的氧化誘導(dǎo)時(shí)間IPA，根據(jù)方程確定此時(shí)的過(guò)氧化值CA。選定空白組的過(guò)氧化值達(dá)某一固定值CB，此時(shí)的時(shí)間減去誘導(dǎo)時(shí)間IPB。其余組別根據(jù)上述方程求出樣品的過(guò)氧化值達(dá)到CA時(shí)所需的時(shí)間，即為誘導(dǎo)時(shí)間，過(guò)氧化值達(dá)到CB的時(shí)間減去IPA即為傳播時(shí)間IPB。

協(xié)同價(jià)按下式計(jì)算：

式中：S為協(xié)同價(jià)；A1、A2為酚類物質(zhì)和VE；S小于0表示A1和A2呈拮抗作用，數(shù)值越小，代表拮抗作用越強(qiáng)；S等于0表示A1和A2為加和作用；S大于0表示A1和A2呈協(xié)同作用，數(shù)值越大，代表協(xié)同作用越強(qiáng)；若IPA1=IP0，且IPA2≠IPA1＋A2≠IP0，則A1對(duì)A2起增效作用；若IPA1=IP0，且IPA2=IPA1＋A2≠IP0，則A1與A2無(wú)作用。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉籽油常溫貯藏穩(wěn)定性分析

過(guò)氧化值主要反映油脂氧化的初級(jí)階段，是用來(lái)測(cè)定油脂在貯藏過(guò)程中氧化的初級(jí)產(chǎn)物量[24-26]，過(guò)氧化值國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為6 mmol/kg。酸值主要表示油脂中游離脂肪酸的含量，油脂在貯藏過(guò)程中發(fā)生水解或熱裂解反應(yīng)從而導(dǎo)致游離脂肪酸的增加，GB/T 2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)食用植物油有統(tǒng)一的最高限量標(biāo)準(zhǔn)，即食用植物油成品油酸值不大于3 mg/g，植物原油的酸值不大于4 mg/g[27]。如圖1所示，茶葉籽油過(guò)氧化值、酸值隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，茶葉籽油過(guò)氧化值在4月和8月時(shí)出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，這是因?yàn)檫^(guò)氧化值反映的是油脂中氫過(guò)氧化物的含量，氫過(guò)氧化物由油脂中的不飽和酯在氧化過(guò)程中形成，性質(zhì)極不穩(wěn)定，易進(jìn)一步分解形成醛、酮、酸等小分子物質(zhì)，這意味著油脂氧化形成氫過(guò)氧化物的同時(shí)也伴隨著氫過(guò)氧化物的分解，是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，由此推測(cè)在這兩段時(shí)間里，茶葉籽油中氫過(guò)氧化物進(jìn)行降解反應(yīng)速度大于生成速度，所以出現(xiàn)了過(guò)氧化值下降的現(xiàn)象[28]。12 個(gè)月后過(guò)氧化值和酸值分別達(dá)3.27 mmol/kg和1.78 mg/g，均在安全質(zhì)量范圍之內(nèi)。徐莉等[29]測(cè)定橄欖油常溫條件下貯藏35 d時(shí)過(guò)氧化值為5 mmol/kg；呂艷春等[30]測(cè)定了大豆毛油常溫貯藏5 個(gè)月后過(guò)氧化值達(dá)14 mmol/kg。與上述植物油相比，茶葉籽油在常溫條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐貯性，這可能是源于其富含酚類、VE、甾醇等活性抗氧化物質(zhì)。其中酚類及VE在油脂氧化穩(wěn)定性方面貢獻(xiàn)突出，而關(guān)于這2 種物質(zhì)的抗氧化能力及相互作用關(guān)系則需進(jìn)一步探討。

圖1 常溫貯藏條件下茶葉籽油過(guò)氧化值和酸值的變化Fig. 1 Changes in peroxide value and acid value of tea seed oil during storage at room temperature

2.2 茶葉籽油酚類物質(zhì)和VE的抗氧化活性及相互作用分析

2.2.1 茶葉籽油和豬油的活性成分及理化指標(biāo)

表1 茶葉籽油和豬油各活性成分與理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical properties and bioactive components of tea seed oil and lard

如表1所示，茶葉籽油中總酚與VE含量較高，極可能是茶葉籽油中的主要天然抗氧化劑，賦予茶葉籽油較強(qiáng)的抗氧化能力，抑制或延緩不飽和脂肪酸的氧化酸敗，成為茶葉籽油耐貯性強(qiáng)的本質(zhì)原因。然而，茶葉籽油酚類物質(zhì)組成非常復(fù)雜，會(huì)干擾其對(duì)茶葉籽油抗氧化效果的測(cè)定。豬油中總酚與VE等天然抗氧化成分含量較低，體系較簡(jiǎn)單。因此，以豬油為研究體系，采用Schaal法（63±1）℃烘箱加速氧化，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 加速氧化過(guò)程中茶葉籽油和豬油的氧化穩(wěn)定性分析

表2 加速氧化過(guò)程中茶葉籽油和豬油的氧化指標(biāo)變化Table 2 Change in oxidation indexes of tea seed oil and lard during accelerated oxidation

茴香胺值和丙二醛含量能很好地反映油脂氧化程度[31-32]。但丙二醛主要用于動(dòng)物油脂氧化穩(wěn)定性的測(cè)定，尤其用于反映豬油的氧化酸敗程度，因此未對(duì)茶葉籽油進(jìn)行丙二醛含量的分析。由表2可知，在加速氧化過(guò)程中，茶葉籽油和豬油的各氧化指標(biāo)均隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，但豬油的上升速率要顯著高于茶葉籽油，在加速氧化30 d后，豬油過(guò)氧化值是茶葉籽油的5.41 倍，茴香胺值是茶葉籽油的1.51 倍。結(jié)合表1可以看出，茶葉籽油總酚和VE的含量分別是豬油的16.33 倍和3.83 倍，因此推測(cè)茶葉籽油較好的氧化穩(wěn)定性與其具有較高含量的活性物質(zhì)密切相關(guān)。由于豬油中活性物質(zhì)含量較低，因此以豬油為載體，探究茶葉籽油中酚類物質(zhì)和VE對(duì)豬油氧化穩(wěn)定性的影響及二者的相互作用類型，可有效降低油脂中原有活性物質(zhì)的干擾。

2.2.3 加速氧化過(guò)程中VE對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響

由表3可知，在添加VE后，豬油的氧化穩(wěn)定性顯著提高，加速氧化30 d后過(guò)氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了72.97%、3.83%、54.62%、47.83%。結(jié)合表4的相關(guān)性分析可進(jìn)一步證明VE對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性具有重要貢獻(xiàn)。

表3 加速氧化過(guò)程中添加VE的豬油氧化指標(biāo)及VE含量變化Table 3 Changes in oxidation indexes and VE content of lard with added VE during accelerated oxidation

表4 VE與各氧化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of VE with each oxidation index

2.2.4 加速氧化過(guò)程中酚類物質(zhì)對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響

表5 加速氧化過(guò)程中添加酚類物質(zhì)的豬油氧化指標(biāo)及總酚含量變化Table 5 Changes in oxidation indexes and polyphenol content of lardwith added polyphenols during accelerated oxidation

由表5可知，在添加茶葉籽油酚類物質(zhì)后，豬油的氧化穩(wěn)定性較空白組和添加VE組均有顯著提高。加速氧化30 d后過(guò)氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了80.54%、2.87%、72.26%、71.74%，對(duì)比添加VE組可知，酚類物質(zhì)抑制油脂氧化產(chǎn)物的生成效果明顯高于VE，尤其在抑制二級(jí)氧化產(chǎn)物的生成上貢獻(xiàn)突出，可能是因?yàn)閂E分子中芳香烴環(huán)上只有一個(gè)氫被羥基取代，而酚類物質(zhì)中有多個(gè)羥基，且酚類物質(zhì)比VE多2 個(gè)苯環(huán)，酚類物質(zhì)分子被氧化后產(chǎn)生的自由基間也會(huì)互相作用，生成新的酚型化合物，發(fā)揮抗氧化功能，故其抗氧化能力相對(duì)于VE會(huì)更強(qiáng)[33-36]。表6的相關(guān)性分析進(jìn)一步證明油脂的氧化穩(wěn)定性與茶葉籽油酚類物質(zhì)尤其是酚類物質(zhì)的含量密切相關(guān)。

表6 酚類物質(zhì)與各氧化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of polyphenols with each oxidation index

2.2.5 加速氧化過(guò)程中VE和酚類物質(zhì)共同存在對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響

表7 加速氧化過(guò)程中添加VE和酚類物質(zhì)的豬油氧化指標(biāo)及VE和總酚含量變化Table 7 Changes in oxidation indexes, VE, polyphenols of lard with addition of VE and polyphenols during accelerated oxidation

表8 VE、酚類物質(zhì)與各氧化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 8 Correlation analysis of VE and polyphenols with each oxidation index

由表7可知，加速氧化30 d后過(guò)氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了92.97%、6.22%、80.20%、80.43%，表明二者同時(shí)添加后，氧化產(chǎn)物的生成得到顯著抑制，與分別添加相比，抗氧化能力顯著增強(qiáng)。結(jié)合表8的相關(guān)性分析，與VE相比，酚類物質(zhì)與各氧化指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)較大，表明其抗氧化貢獻(xiàn)越大。

2.2.6 VE和酚類物質(zhì)抗氧化相互作用分析

作空白豬油組過(guò)氧化值與時(shí)間的關(guān)系圖，通過(guò)雙切線法求得其氧化誘導(dǎo)時(shí)間為14.72 d。油脂氧化反應(yīng)在動(dòng)力學(xué)上屬于一級(jí)反應(yīng)。作油脂的ln（1/POV）-t圖，求得一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k和相關(guān)系數(shù)（R2）。空白豬油組的一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k為0.132 8，R2=0.913 9；豬油＋VE組的一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k為0.088，R2=0.949 8；豬油＋酚類物質(zhì)組的一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k為0.064 3，R2=0.953 4；豬油＋VE＋酚類物質(zhì)組的一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k為0.044 6，R2=0.989 1。根據(jù)方程確定此時(shí)的過(guò)氧化值CA為14.98 mmol/kg，其余組別根據(jù)上述方程求出樣品的過(guò)氧化值達(dá)到CA時(shí)所需的時(shí)間，即為誘導(dǎo)時(shí)間，豬油＋VE組的氧化誘導(dǎo)時(shí)間為21.59 d；豬油＋酚類物質(zhì)組的氧化誘導(dǎo)時(shí)間為31.42 d；豬油＋VE＋酚類物質(zhì)組的氧化誘導(dǎo)時(shí)間為49.78 d。IP0=14.72 d，IPA1=21.59 d，IPA2=31.42 d，IPA1＋A2=49.78 d。求得S為48.75%，S大于0表示A1和A2呈協(xié)同作用，數(shù)值越大，代表協(xié)同作用越強(qiáng)。由此可知，在豬油恒溫加速氧化過(guò)程中，VE與茶葉籽油酚類物質(zhì)呈協(xié)同作用。

3 結(jié) 論

在室溫條件下貯藏1 a，茶葉籽油酸值和過(guò)氧化值上升非常緩慢，表明茶葉籽油品質(zhì)穩(wěn)定，耐貯性強(qiáng)。在此過(guò)程中，茶葉籽油酚類物質(zhì)和VE含量緩慢下降表明它們參與了抑制油脂自動(dòng)氧化過(guò)程，但并未被大量消耗。在模擬茶葉籽油中酚類物質(zhì)和VE在豬油氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，各組豬油的過(guò)氧化值、酸值、茴香胺值都逐漸增加，同時(shí)，VE和總酚含量逐漸下降，在加速氧化前期，氧化指標(biāo)上升緩慢，活性成分含量迅速下降，氧化后期氧化指標(biāo)迅速上升，活性成分含量下降趨勢(shì)變緩，各氧化指標(biāo)的上升趨勢(shì)與活性成分的下降趨勢(shì)基本一致，二者呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性。豬油添加VE后的氧化穩(wěn)定性顯著提高，加速氧化30 d后過(guò)氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了72.97%、3.83%、54.62%、47.83%；在添加酚類物質(zhì)后，加速氧化30 d后過(guò)氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了80.54%、2.87%、72.26%、71.74%，不同組別的氧化指標(biāo)上升趨勢(shì)：豬油＞豬油＋VE＞豬油＋酚類物質(zhì)＞豬油＋VE＋酚類物質(zhì)。結(jié)果表明，茶葉籽油酚類物質(zhì)和VE都能大幅度延緩豬油的氧化酸敗，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性，且茶葉籽油酚類物質(zhì)抗氧化效果優(yōu)于VE。經(jīng)相互作用分析，在豬油恒溫加速氧化過(guò)程中，VE與茶葉籽油酚類物質(zhì)呈協(xié)同作用。以豬油代替其他油脂模擬油脂自身活性成分對(duì)其氧化穩(wěn)定性的影響及相互作用關(guān)系，盡可能避免油脂中其他活性成分的干擾，為油脂氧化穩(wěn)定性的相關(guān)研究提供方法學(xué)參考。由于茶葉籽油中酚類物質(zhì)種類復(fù)雜，其內(nèi)在的抗氧化作用機(jī)制及相互作用關(guān)系還有待深入研究。