周緒霞，陳 婷，呂 飛，顧賽麒，劉建華，丁玉庭*

蛋清蛋白具有凝膠性、持水性、起泡性和乳化性等多種功能特性，在食品工業(yè)中有著廣泛應(yīng)用，常用于火腿、臘腸、魚糜制品等的增稠劑及面類制品的增強(qiáng)劑。如何進(jìn)一步改善雞蛋清蛋白的功能特性也一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)改性主要通過改變蛋白質(zhì)氨基酸殘基和多肽鏈結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)大分子的空間結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變，從而獲得更好的功能特性[1]。目前常用的方法包括物理法、化學(xué)法和生物酶法等[2]。但是物理改性存在耗時長、效果不明顯等缺點(diǎn)，生物酶法則對反應(yīng)條件要求苛刻，且成本較高，而化學(xué)改性方法則可能存在一定安全隱患。因此探索一種經(jīng)濟(jì)安全高效的改性方法對改善蛋清蛋白的凝膠等功能特性具有重要意義。

多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的、具有許多活性基團(tuán)的多元酚類化合物，其能以氫鍵、疏水作用力、共價鍵等與蛋白質(zhì)結(jié)合而對蛋白質(zhì)產(chǎn)生改性作用[3]。Asano等[4]認(rèn)為，多酚的大量酚羥基與蛋白質(zhì)主鏈的肽基NH—CO，側(cè)鏈上的—OH、—NH2以及—COOH以氫鍵的形式多點(diǎn)結(jié)合。目前關(guān)于多酚與蛋白質(zhì)的相互作用的研究已有報道[5-7]。Staszewski等[8]研究表明，綠茶多酚能通過加速β-乳球蛋白或酪蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成而對β-乳球蛋白凝膠的黏彈性有顯著影響，且對蛋白質(zhì)生物活性無影響。Jia Na等[9]研究表明，高濃度的兒茶素會通過阻礙凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成、掩蓋蛋白質(zhì)的活性功能基團(tuán)而影響豬肉肌原纖維蛋白的功能特性。Wu Weiguo等[10]研究表明，低添加量的綠茶提取物能提高蛋清蛋白的發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性。Hatanaka等[11]發(fā)現(xiàn)，紅茶、綠茶、烏龍茶的茶葉提取物改性作用可顯著提高蛋清蛋白凝膠的黏彈性，并有助于其形成更緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。但目前關(guān)于茶多酚與蛋清蛋白相互作用對蛋清蛋白凝膠特性影響及其內(nèi)在機(jī)理變化的研究鮮見報道。

為此，本實(shí)驗(yàn)以茶多酚為研究對象，研究不同添加量的茶多酚對蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度、持水力以及微觀結(jié)構(gòu)等特性的影響，探討茶多酚改性對蛋清蛋白表面疏水性和巰基含量的影響，并通過差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transformed infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）法對改性蛋清蛋白熱穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，揭示茶多酚與蛋清蛋白的作用機(jī)理，為日后生產(chǎn)更高凝膠特性的蛋清蛋白并拓寬其應(yīng)用范圍提供的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

散裝蘊(yùn)康土雞蛋 杭州世紀(jì)聯(lián)華和平店；茶多酚（食品級） 上海夢荷生物科技有限公司；Tris、甘氨酸、尿素（均為分析純） 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、無水乙醇（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱水浴磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司；TA.XT.Plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；E-201-C pH復(fù)合電極 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ARL Advant X熒光光譜儀、Nicolet 6700 FTIR儀 美國Thermo公司；SP-75紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Q100 DSC儀美國TA公司；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；S-4700（II）掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取新鮮無破殼的雞蛋分離出蛋清液，用磁力攪拌器攪拌均勻后除去上層泡沫，蛋清蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測定，然后分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的茶多酚并攪拌均勻。將混合好的溶液置于恒溫水浴磁力攪拌器中，在（25±1）℃條件下反應(yīng)90 min[12]，反應(yīng)完畢后，將改性后的蛋清蛋白溶液置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 蛋清蛋白凝膠制備

分別取40 mL改性后的各組蛋清蛋白-茶多酚溶液灌入直徑為21 mm的人造腸衣中，兩端扎緊，然后置于90 ℃水浴鍋中恒溫水浴30 min，取出后迅速放入冰水浴中冷卻至常溫，放入4 ℃冰箱中冷藏過夜[13]，測定各指標(biāo)。

1.3.3 凝膠強(qiáng)度的測定

采用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀測定樣品的凝膠強(qiáng)度。將蛋清蛋白凝膠切成直徑21 mm、長25 mm的圓柱體，采用直徑為0.5英寸的圓柱狀平頭探頭，測定條件為：測前速率2 mm/s，測試速率2 mm/s，測后速率5 mm/s，觸發(fā)力5.0 g，下壓距離為15 mm。凝膠強(qiáng)度用硬度即探頭下壓過程中的最大感應(yīng)力（單位g）表示，每組樣品平行測定8 次取平均值。

1.3.4 凝膠持水力的測定

稱取一定質(zhì)量（m1）的蛋白凝膠，用一層濾紙包裹，置于50 mL離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，離心完畢后取出樣品并稱質(zhì)量（m2），按公式（1）計算失水率：

1.3.5 表面疏水性的測定

參考遲玉杰等[14]的方法測定。將改性樣品溶液用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.01 mol/L）分別配制成1、2、3、4 mg/mL和5 mg/mL的蛋白溶液（蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測定）。取各蛋白樣品溶液4 mL，分別加入20 μL 8-苯氨基-1-萘磺酸溶液（8 mmol/L），混合均勻后在室溫條件下靜置15 min，設(shè)置激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長470 nm，利用熒光光譜儀測定樣品的熒光強(qiáng)度，以未加8-苯氨基-1-萘磺酸的蛋白溶液的熒光強(qiáng)度為空白。以相對熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)濃度作圖，采用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，直線斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性。以原蛋白的表面疏水性為100%計，計算改性蛋清蛋白的表面疏水性的相對百分比。

1.3.6 巰基含量的測定

參考Plancken等[15]的方法并略作修改。將樣品溶液稀釋2 倍，然后取1 mL樣品溶液加入4 mL包含0.01 mol/L的乙二胺四乙酸的Tris-甘氨酸（pH 8.0，0.1 mol/L）緩沖液，混合均勻后，在40 ℃條件下保溫30 min，加入125 μL 5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）試劑（20 mg DTNB溶于pH 8.0 5 mL 0.1 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液），25 ℃條件下保溫10 min，測定412 nm波長處的吸光度。

總巰基含量的測定：所用的Tris-甘氨酸緩沖液中另含有0.25 g/mL十二烷基硫酸鈉，其他條件與表面巰基的測定相同。按公式（2）計算總巰基含量：

式中：C為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為樣品稀釋倍數(shù)，5.125。

以原蛋清中巰基數(shù)為100%計，計算改性蛋清中巰基相對含量。

1.3.7 DSC分析

參考Iesel等[16]的方法。準(zhǔn)確稱取1.3.1節(jié)中反應(yīng)好的樣品放入鋁坩堝中，密封，并用相同的空坩堝作參比，以5 ℃/min的升溫速率從25 ℃加熱到105 ℃。整個過程均在干燥N2條件下進(jìn)行，吹掃氣速率20 mL/min，保護(hù)氣速率60 mL/min。

1.3.8 FTIR分析

參考Cheng Zhengjun等[17]的方法。將反應(yīng)后的樣品進(jìn)行冷凍干燥，然后準(zhǔn)確稱取1～3 mg樣品，加入100～300 mg磨細(xì)的干燥溴化鉀，研磨成均勻干燥的粉末，壓成薄片，利用FTIR儀收集樣品的紅外圖譜，設(shè)置波長范圍4 000～400 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描次數(shù)32 次，溫度25 ℃，以空氣為背景，每個樣品掃描前扣除背景。通過OMNIC V8.0軟件對1 600～1 700 cm－1位置進(jìn)行傅里葉去卷積，將去卷積圖譜進(jìn)行二階導(dǎo)，比較帶的位置和數(shù)目，以保證不被過度去卷積，二級結(jié)構(gòu)含量的定量分析通過Gausse函數(shù)對圖譜進(jìn)行多次擬合，然后根據(jù)各子峰與不同二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系及其積分面積，計算出各種二級結(jié)構(gòu)的相對含量[18]。

1.3.9 凝膠掃描電鏡分析

參考Salvador等[19]的方法。將凝膠樣品中心部位切成小塊，用2.5%的戊二醛溶液浸泡固定，4 ℃條件下放置24 h。固定好的樣品在室溫條件下用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.01 mol/L）漂洗3 次，每次10 min，然后依次用體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%、90%及100%的乙醇溶液分別浸泡20 min，逐級脫水，之后再用叔丁醇浸泡3 次，每次10 min，然后將處理好的樣品進(jìn)行冷凍干燥。干燥后的樣品用導(dǎo)電雙面膠固定到樣品臺上，經(jīng)濺射儀噴金后，置于掃描電鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較（P＜0.05，差異顯著），采用Origin 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠強(qiáng)度的變化

圖1 茶多酚添加量對改性蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 1 Effect of tea polyphenols addition on gel strength of modified egg white protein

由圖1可以看出，茶多酚改性可明顯增加蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度，且茶多酚添加量越多，增加越明顯。當(dāng)茶多酚添加量為0.8%時，改性蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度達(dá)到720.7 g，比未改性蛋清蛋白凝膠提高了130.2%（313.1 g）。茶多酚富含大量活性羥基，能與蛋白質(zhì)主鏈的肽基NH—CO，側(cè)鏈上的—OH、—NH以及—COOH以氫鍵的形式多點(diǎn)結(jié)合，同時吸附大量水分子，增加蛋白質(zhì)的水合能力，同時減少水溶性蛋白對凝膠形成的影響，提高凝膠結(jié)構(gòu)的致密性[20]，最終使得改性后的蛋清蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)更加穩(wěn)定。因此蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度的增加可能歸因于茶多酚與蛋清蛋白之間發(fā)生了交聯(lián)作用，促進(jìn)了蛋清蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。有研究認(rèn)為，多酚具有多羥基結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)的親水能力，而蛋白質(zhì)兼具親水親油性，多酚的親水基團(tuán)能夠與蛋白質(zhì)的親油基團(tuán)發(fā)生氫鍵作用形成緊密的結(jié)構(gòu)[21]。當(dāng)茶多酚添加量增加到0.8%時，凝膠強(qiáng)度上升趨勢減緩，推測此時茶多酚與蛋清蛋白的結(jié)合已趨于飽和[22]。

2.2 蛋清蛋白凝膠持水性的變化

圖2 茶多酚添加量對改性蛋清蛋白凝膠失水率的影響Fig. 2 Effect of tea polyphenol addition on expressible moisture content of modified egg white protein gel

由圖2可以看出，蛋清蛋白經(jīng)茶多酚改性后失水率顯著降低。與未改性的凝膠相比，隨著茶多酚添加量的增加，蛋白凝膠失水率持續(xù)下降，當(dāng)茶多酚添加量為0.8%時，凝膠持失水率達(dá)到最低，從29.41%降至19.29%。這與凝膠強(qiáng)度的變化趨勢相一致，表明茶多酚改性使蛋清蛋白形成更緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有更好的保水性。

2.3 蛋清蛋白表面疏水性的變化

圖3 茶多酚添加量對改性蛋清蛋白表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of tea polyphenols addition on surface hydrophobicity of modified egg white protein

如圖3所示，改性后蛋清蛋白質(zhì)的表面疏水性發(fā)生顯著變化，隨著茶多酚添加量的增加，蛋白質(zhì)的表面疏水性持續(xù)增加。蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)展開后疏水性脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的暴露會導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性的變化，因此，表面疏水性可反映蛋白質(zhì)解折疊的程度[23]。當(dāng)茶多酚與蛋清蛋白發(fā)生作用時，蛋白質(zhì)的分子鏈不斷伸展，分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)不斷暴露，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的不斷增加。有研究認(rèn)為蛋白質(zhì)的表面疏水性在凝膠形成的初期，對立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成起著非常重要的作用[24]。

2.4 蛋清蛋白中巰基含量的變化

圖4 茶多酚添加量對改性蛋清蛋白巰基含量的影響Fig. 4 Effect of tea polyphenols addition on sulfhydryl content of modified egg white protein

Matsudomi等[25]研究表明蛋白的總巰基數(shù)和表面巰基數(shù)對蛋白質(zhì)的凝膠性能起著明顯的作用。而巰基和二硫鍵是蛋白質(zhì)分子中穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要化學(xué)鍵，會影響蛋白質(zhì)凝膠性、持水性等功能特性[26]。如圖4所示，隨著茶多酚添加量的增加，蛋清蛋白中總巰基含量不斷下降，而表面巰基的含量不斷增加。這可能是由于蛋清蛋白與茶多酚在相互作用的過程中，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化，一方面，蛋清蛋白質(zhì)改性后分子結(jié)構(gòu)展開，使得包埋于分子內(nèi)部的巰基不斷暴露出來，造成了表面巰基含量的增加，暴露于表面的巰基數(shù)增多，分子間和分子內(nèi)的相互作用增強(qiáng)，蛋清蛋白的凝膠性能提高；另一方面，由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部或分子間的巰基氧化反應(yīng)或巰基/二硫鍵交換反應(yīng)形成更多二硫鍵[27]，最終導(dǎo)致了總巰基含量的下降。

2.5 DSC分析

圖5 茶多酚添加量對改性蛋清蛋白熱特性的影響Fig. 5 Effect of tea polyphenols addition on thermal properties of modified egg white protein

由圖5可以看出，每組蛋清蛋白樣品都出現(xiàn)了2 個吸收峰T1和T2，第1個峰為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白變性峰，第2個峰為卵清蛋白變性峰[10]。隨著茶多酚添加量的增加，2 個吸收峰均向右遷移。原蛋清蛋白的2 個吸收峰分別是67.5 ℃和84.2 ℃，當(dāng)添加0.8%的茶多酚時，改性后的蛋清蛋白的2 個吸收峰分別遷移至69.9 ℃和88.9 ℃，表明茶多酚改性有效提高了蛋清蛋白的熱穩(wěn)定性。推測由于茶多酚中的活性羥基與蛋清蛋白質(zhì)主鏈以及側(cè)鏈上的基團(tuán)多點(diǎn)結(jié)合，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加緊密，不易被破壞，從而增加了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。Wang Xiaoya等[28]在研究表沒食子兒茶素表沒食子酸酯與α-乳白蛋白交聯(lián)作用中得到了類似的結(jié)論，并認(rèn)為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的增加是由于多酚與蛋白質(zhì)之間發(fā)生了共價交聯(lián)作用。

2.6 FTIR分析

圖6 不同添加量茶多酚改性蛋清蛋白的FTIR圖譜Fig. 6 FTIR spectra of egg white proteins modified with different amounts of tea polyphenols

如圖6所示，蛋白質(zhì)的酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）主要是由C=O的伸縮振動引起的，與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。蛋白質(zhì)分子內(nèi)多肽鏈可形成螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲等特定的二級結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋和β-折疊屬于緊密有序結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角屬于比較松散的部分有序結(jié)構(gòu)，而無規(guī)則卷曲為松散的無序結(jié)構(gòu)?；贘ackson等[29]提出的理論，1 600～1 639 cm-1為β-折疊，1 640～1 650 cm-1為無規(guī)則卷曲，1 651～1 660 cm-1為α-螺旋，1 661～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，據(jù)此計算出的蛋清蛋白各二級結(jié)構(gòu)相對含量如表1所示。隨著茶多酚添加量的增加，α-螺旋相對含量不斷下降，而β-折疊相對含量顯著上升，這表明茶多酚改性在一定程度上破壞了蛋清蛋白原有的剛性結(jié)構(gòu)，柔性結(jié)構(gòu)增加，使分子由有序變?yōu)闊o序，表明多酚會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，這個結(jié)果與Jia Jingjing[30]和Hasni[31]等的結(jié)果相類似。茶多酚與蛋清蛋白分子發(fā)生反應(yīng)時，用于穩(wěn)定α-螺旋的蛋白質(zhì)氫鍵斷裂，蛋白質(zhì)活性基團(tuán)逐漸暴露參與凝膠形成，進(jìn)而使得蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度得到改善。董昳廷[32]研究發(fā)現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的變化與β-折疊結(jié)構(gòu)分別凝膠持水性和凝膠強(qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系。因此推測蛋清蛋白改性后凝膠強(qiáng)度與失水率的變化與蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)相對含量變化有關(guān)，而兩者之間的具體聯(lián)系，有待日后進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 不同茶多酚添加量對蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effects of dtea polyphenols addition on secondary structures of egg white protein

2.7 凝膠微觀結(jié)構(gòu)

凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成是蛋白質(zhì)變性的結(jié)果，導(dǎo)致了分子間發(fā)生共價和非共價相互作用，同時還包括二硫鍵和疏水性相互作用[13]。由圖7可知，未添加茶多酚的原蛋清凝膠表面粗糙不均勻，而經(jīng)茶多酚改性后蛋清蛋白可以形成表面更加有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并且隨著茶多酚添加量的增加，凝膠表面更加平滑，均勻。這可能是由于茶多酚含有的活性羥基與蛋清蛋白主鏈或側(cè)鏈上的基團(tuán)發(fā)生了交聯(lián)作用，進(jìn)而形成更加有序均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越均勻致密，其凝膠性越好，這與凝膠強(qiáng)度的結(jié)果相一致。

圖7 不同添加量茶多酚改性蛋清蛋白凝膠的掃描電鏡圖Fig. 7 SEM images of egg white protein gels modified with different amounts of tea polyphenols

3 結(jié) 論

利用茶多酚對蛋清蛋白進(jìn)行改性，研究表明，當(dāng)茶多酚添加量達(dá)到0.8%時，改性蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度提高了130.2%，失水率從29.41%降至19.29%；改性蛋清蛋白的熱穩(wěn)定性增加，即蛋白質(zhì)的2 個熱吸收峰分別從67.5 ℃和84.2 ℃提升至69.9 ℃和88.9 ℃。這一方面與茶多酚改性增強(qiáng)了蛋清蛋白的表面疏水性和表面巰基含量有關(guān)，另一方面則與蛋清蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，即隨著茶多酚添加量的增加，α-螺旋相對含量不斷下降，而β-折疊相對含量顯著上升，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)由有序變?yōu)闊o序。當(dāng)茶多酚的添加量達(dá)到0.8%時，其凝膠強(qiáng)度與失水率不再發(fā)生顯著性變化，推測蛋清蛋白質(zhì)與茶多酚的結(jié)合點(diǎn)達(dá)到飽和。