皮慶猛 王曉磊 張志亮 周碧玉 任曉蕓 陸毅 黃一雄 傅敏剛 范志宏

硬材料3D打印已經(jīng)展現(xiàn)了廣泛的研究和應(yīng)用價(jià)值，但是生物打印的研究尚處在早期階段。為實(shí)現(xiàn)具有功能的生物活性組織的精確打印，理想的可打印生物材料應(yīng)具有良好的生物相容性、支架結(jié)構(gòu)具備良好孔隙率，并兼有降解性及快速可塑性[1-3]。由于可打印生物材料的限制，利用生物打印技術(shù)，快速構(gòu)建復(fù)雜空腔組織或器官尚面臨巨大挑戰(zhàn)。

目前，較常用的可生物打印材料主要為水凝膠成分，一般是借助交聯(lián)的方法實(shí)現(xiàn)打印過(guò)程中由液相向固相轉(zhuǎn)變，即凝膠化[4]。甲基丙烯酸酐化明膠（GelMA）是一種明膠衍生物，經(jīng)化學(xué)修飾后，可經(jīng)UV照射快速交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[5]。文獻(xiàn)報(bào)道GelMA 5%（m/v）～10%（m/v）交聯(lián)后具有良好的細(xì)胞相容性，同時(shí)具有一定的打印可塑性[6]。海藻酸鹽（Alginate）具有Ca2+快速交聯(lián)的特性，但細(xì)胞在該種水凝膠里生長(zhǎng)緩慢，伸展受限，濃度越高越不利于細(xì)胞生長(zhǎng)[7]。在生物打印時(shí)一般將其濃度控制在1%（m/v）～2%（m/v）。

我們的前期研究證實(shí)，利用復(fù)合水凝膠可同時(shí)打印含有血管內(nèi)皮細(xì)胞和BMSC的單層管狀結(jié)構(gòu)，打印后結(jié)構(gòu)可實(shí)現(xiàn)灌注功能，細(xì)胞-支架復(fù)合物在體外可長(zhǎng)期存活，并能在結(jié)構(gòu)內(nèi)鋪展[8]。本實(shí)驗(yàn)以GelMA和Alginate為打印生物墨水，采用離子交聯(lián)（Ca2+）和光交聯(lián)快速分步固化的方法，探討3D生物打印具有亞層次結(jié)構(gòu)的復(fù)合空腔管狀組織的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬源明膠（Gelatine，type-A，300 bloom）、甲基丙烯酸酐（Methacrylic Anhydride，MW=154.16 KDa）、海藻酸鹽（Sodium alginate，MW=33 KDa，low viscosity）、氯化鈣、EDTA等購(gòu)自Sigma公司。胎牛血清、PBS、HEPES緩沖液、0.25%胰酶、高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM等購(gòu)自Gibico公司。細(xì)胞活力檢測(cè)（Live/dead）試劑盒、細(xì)胞增殖能力檢測(cè)試劑盒（Prestoblue）、細(xì)胞骨架蛋白 F-actin（Alexa-594、Alexa-488）、細(xì)胞核染料DAPI、Celltracker（綠、紅）、Microbeads（綠、紅）等購(gòu)自Life Technologies公司。

Instron生物力學(xué)檢測(cè)儀 （Model5542，美國(guó)），RHEOPLUS-32 流變儀（Anton Paar，德國(guó)），3D 生物打印機(jī) NovoGen MMX bioprinter（Organovo，美國(guó)），多通道打印噴頭由本實(shí)驗(yàn)室自行組裝。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合水凝膠制備

①制備GelMA：豬源明膠10 g，溶于無(wú)菌100 mL PBS中攪拌，240 r/min、50℃恒溫溶解1 h；緩慢加入1.25 mL甲基丙烯酸酐，240 r/min、50℃恒溫溶解2 h；加入100 mL PBS稀釋混勻，轉(zhuǎn)入濾膜攪拌透析5～7 d，40 ℃、500 r/min，每日更換透析液（去離子水）2次；透析結(jié)束后，無(wú)菌濾網(wǎng)（Millipore）過(guò)濾，分裝至50 mL離心管，-80℃冷凍存放2～3 d；依次凍干機(jī)凍干5～7 d，室溫存放備用。②基礎(chǔ)工作液：200 mL滅菌水加入10%FBS，緩沖液HEPES調(diào)整pH值至7.4。 ③稱取GelMA 7%（w/v）分別與 1%、2%、3%（w/v）的Alginate，兩兩混合溶于基礎(chǔ)工作液，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，即：GA1、GA2、GA3，單純 GelMA 和 Alginate 組為對(duì)照組。④輕微震動(dòng)、加熱搖勻5 min后，放置37℃培養(yǎng)箱備用。

1.2.2 生物力學(xué)檢測(cè)

①制備PDMS模具：將PDMS液相A/B劑按照10∶1配比，80℃烤箱烘干固化1 h，做成直徑1 cm、高度0.8 mm的圓柱狀孔型模具。75%乙醇浸泡消毒30 min，備用。②無(wú)菌3%CaCl2200 μL滴入孔中浸潤(rùn)覆蓋底部，備用。③將不同配比的復(fù)合水凝膠（GA1，GA2，GA3，GelMA 和 Alginate 五組）， 分別滴加入孔中，表面與孔周平面平齊。④表面再次滴加3%CaCl2200 μL，交聯(lián)后備用；每組4個(gè)樣本。⑤樣本放入U(xiǎn)V燈下8 cm處，波長(zhǎng)360～480 nm，6.9 mw/cm2交聯(lián)30 sec。⑥將樣本逐一放入Instron生物力學(xué)檢測(cè)臺(tái)上，以1 mm/min 60%的力壓縮樣本，采用Bluehill軟件分析記錄壓縮距離compression（mm）和壓力load（N），取曲線0%～10%的形變區(qū)間計(jì)算楊氏模量。

1.2.3 打印可塑性檢測(cè)

①將不同復(fù)合水凝膠分別均分為2份，加入綠色（內(nèi)層）和紅色（外層）顏料Microbeads，振動(dòng)混勻，分別移入兩支3 mL注射器，并固定于打印機(jī)器NovoGen MMX bioprinter的助推泵上。②將綠色管與紅色管與多通道打印噴頭分別以軟管鏈接，以打印不同層次，以heater維持周圍溫度。③3%CaCl2同樣注射器吸取3 mL后，連接打印噴頭并固定。④通過(guò)調(diào)節(jié)打印噴頭行進(jìn)速度及不同通道間的推進(jìn)流速，以打印出穩(wěn)定的空心管結(jié)構(gòu)。⑤將打印出的空心結(jié)構(gòu)，取橫斷面置于熒光顯微鏡下觀察，以確定具有內(nèi)、外雙層結(jié)構(gòu)。

1.2.4 復(fù)層管腔組織打印

①無(wú)菌復(fù)合水凝膠G7A2兩份各3 mL，置37℃培養(yǎng)箱備用。②取狀態(tài)良好的小鼠成纖維細(xì)胞3T3，分為兩組，分別用綠色、紅色Celltracker標(biāo)記，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為2×106個(gè)，消化離心后，去上清，保留細(xì)胞團(tuán)塊，備用。③分別用復(fù)合水凝膠液重懸細(xì)胞團(tuán)塊，輕輕混勻，移入注射器內(nèi)，并固定于打印機(jī)推進(jìn)泵上，連接軟管。④以無(wú)菌3%CaCl2注射器吸取3 mL后，連接打印噴頭并固定。⑤調(diào)整打印噴頭速度及推進(jìn)速度，以打印出復(fù)層結(jié)構(gòu)管狀組織。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每3日換液。⑥分別在第 1、3、7、10、14 和 21 天，取樣本組織塊，以 live/dead試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。⑦不同時(shí)間點(diǎn)取樣本，將標(biāo)記后的樣本于倒置熒光顯微鏡下觀察，不同視野隨機(jī)取3個(gè)區(qū)域，拍照。⑧分析比較各組在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力的差異。

1.2.5 打印后復(fù)層管腔組織灌注實(shí)驗(yàn)

①含有內(nèi)外復(fù)層3T的管狀打印方法同前。②將打印后復(fù)層管狀組織用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)24 h。③用27G針頭，固定打印復(fù)層管一端，用含有紅色熒光的灌注液，持續(xù)灌注復(fù)層管狀組織。④熒光紫外燈照射下，視頻記錄灌注情況。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)層空腔組織打印策略

理想的可打印生物水凝膠材料是實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組織構(gòu)建的關(guān)鍵因素。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，海藻酸鹽可以通過(guò)離子鍵（Ca2＋）快速交聯(lián)固化，具有良好的快速打印塑型的能力，但是該種水凝膠材料不利于細(xì)胞在其內(nèi)長(zhǎng)期生長(zhǎng)和鋪展。而明膠衍生物GelMA具有良好的細(xì)胞相容性，被化學(xué)修飾后加上了光敏的酸酐鍵，經(jīng)紫外光交聯(lián)后可彼此形成共價(jià)鍵，從而凝膠固化，但是其力學(xué)性能不夠。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合兩種水凝膠的優(yōu)劣，我們先將復(fù)合水凝膠通過(guò)離子交聯(lián)塑型，再光交聯(lián)固化GelMA，從而實(shí)現(xiàn)在3D生物打印的過(guò)程中快速構(gòu)建管狀結(jié)構(gòu)的目的（圖1A-B）。

復(fù)雜的空腔組織或器官往往具有兩種或以上的亞層次結(jié)構(gòu)，為了實(shí)現(xiàn)不同亞層的差異化構(gòu)建，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種同軸多通道生物打印系統(tǒng)（圖1B）。將不同的亞層組織細(xì)胞類型，跟相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)混合，利用該系統(tǒng)分別將不同層面同時(shí)打印，一次性構(gòu)建兩種或以上的復(fù)層管狀結(jié)構(gòu)（圖1C）。

2.2 復(fù)合水凝膠力學(xué)性能

為了實(shí)現(xiàn)打印過(guò)程中快速交聯(lián)固化，我們采用本實(shí)驗(yàn)室制備的GelMA[9]，打印過(guò)程中我們選擇GelMA的濃度為7%[8]。為了增加空腔管腔結(jié)構(gòu)的力學(xué)強(qiáng)度，我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，將不同濃度（1%、2%、3%）的Alginate分別與7%GelMA混合，力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，復(fù)合水凝膠楊氏模量為（8.78±1.73）×10-3MPa，較單純 GelMA 的楊氏模量（2.38±0.69）×10-3MPa和單純海藻酸鹽的楊氏模量（0.83±0.24）×10-3MPa，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2A）。復(fù)合水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度明顯高于單純對(duì)照組，隨著海藻酸鹽濃度從1%增加到3%，復(fù)合水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度也相應(yīng)增加（圖2B）。這提示兩次交聯(lián)后，組織硬度明顯增加。但是，組織結(jié)構(gòu)過(guò)硬，不利于細(xì)胞在結(jié)構(gòu)內(nèi)鋪展生長(zhǎng)。因此我們將海藻酸鹽的濃度控制在3%以下，在保證可打印的前提下盡量降低海藻酸鹽的濃度。

2.3 打印可塑性

新型設(shè)計(jì)的同軸多通道生物打印系統(tǒng)，利用不同的通道分開(kāi)，同步打印不同的管狀結(jié)構(gòu)的亞層，通過(guò)顏色區(qū)分標(biāo)記。我們發(fā)現(xiàn)，打印后的復(fù)層管狀結(jié)構(gòu)，不同層次間具有明顯區(qū)分（圖3A-C）。內(nèi)、外層結(jié)構(gòu)內(nèi)的顏色標(biāo)記，經(jīng)兩次交聯(lián)后并沒(méi)有相互滲入或混合，這說(shuō)明兩層結(jié)構(gòu)是完全獨(dú)立的，理論上可以實(shí)現(xiàn)解剖剝離。

通過(guò)顯微鏡下定量測(cè)量，內(nèi)、外層管壁的厚度為（62.06±0.45） μm 和（93.78±10.25） μm，提示每層結(jié)構(gòu)可具有人體1～2個(gè)細(xì)胞的厚度。內(nèi)、外管的管徑分別為（663.66±51.74） μm 和（976.84±63.44） μm，與人體內(nèi)微動(dòng)脈、尿道或輸尿管等內(nèi)徑相當(dāng)，說(shuō)明通過(guò)多通道共軸打印系統(tǒng)可獨(dú)立同步構(gòu)建復(fù)層管狀結(jié)構(gòu)。

2.4 復(fù)層管腔組織打印

為明確細(xì)胞對(duì)于復(fù)合水凝膠的相容性，將同等數(shù)量的小鼠成纖維3T3細(xì)胞，與含有不同濃度海藻酸鹽的復(fù)合水凝膠及單純GelMA和海藻酸鹽混勻，利用同軸多通道系統(tǒng)生物打印，依次快速離子交聯(lián)和光交聯(lián)。第 1、3、7 天細(xì)胞活力分別為（88.50%±5.8%）、（85.57%±6.22%）和（96.29%±2.64%）（圖 4A-E）。我們觀察到，細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的打印過(guò)程，打印通道會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定損害，打印第3天的細(xì)胞活力比打印即刻或第一天的活力有所降低，而對(duì)于這一現(xiàn)象，有文獻(xiàn)解釋為打印后細(xì)胞部分失活壞死造成，這與我們觀察到的結(jié)果基本一致。

為了便于觀察不同層次間細(xì)胞是否會(huì)相互滲透，我們打印前將內(nèi)、外層細(xì)胞分別用綠色和紅色的細(xì)胞示蹤劑予以標(biāo)記。打印后4天d，我們發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號(hào)只分布在內(nèi)層，而紅色熒光信號(hào)只分布在外層（圖4F-G）。這說(shuō)明該同軸多通道生物打印系統(tǒng)可同時(shí)打印出復(fù)層空腔管狀結(jié)構(gòu)的不同組織層次，而不同層次的細(xì)胞間可在短期內(nèi)滯留在相應(yīng)的組織層次內(nèi)。

2.5 打印復(fù)層管腔結(jié)構(gòu)的灌注功能

圖1 復(fù)層管狀結(jié)構(gòu)水凝膠打印策略模式圖Fig.1 Design of hydrogel 3D bioprinted hollow structure with multiple layers

為了檢測(cè)管狀組織是否具有灌注功能，我們于打印第一天，將含有3T3細(xì)胞的復(fù)層管狀組織，鏈接27G注射器針頭，持續(xù)灌注含有顏料的溶液，不同時(shí)間點(diǎn)在熒光下拍照、錄像。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)層管狀組織內(nèi)，有色顏料溶液并沒(méi)有滲出到管壁外側(cè)，這說(shuō)明含有雙層細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)的組織管壁完整性良好，能夠?qū)崿F(xiàn)灌注功能（圖5）。

圖2 復(fù)合水凝膠力學(xué)檢測(cè)Fig.2 Mechanical test of blend hydrogels

圖3 復(fù)層管狀結(jié)構(gòu)打印Fig.3 Printing of double-layer structure

圖4 復(fù)層管狀組織打印Fig.4 Bioprinting of hollow tissue with double-layer loading with cells

圖5 復(fù)層管狀組織灌注實(shí)驗(yàn)（Bar=1 cm）Fig.5 Perfusion test of printed tissue with microbeads(Bar=1 cm)

3 討論

3D打印在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如3D打印的人工關(guān)節(jié)、耳蝸、復(fù)雜骨缺損替代物等。但是，3D生物打印尚處在早期研究階段[10]。目前，3D生物打印構(gòu)建單一實(shí)體組織的研究已有報(bào)道，如心肌、軟骨、皮膚等[11]。但是，對(duì)于空腔管狀組織的生物打印，特別是打印復(fù)雜的、具有不同亞層次結(jié)構(gòu)的空腔管狀組織或器官尚無(wú)成功的報(bào)道。

理想的水凝膠是構(gòu)建復(fù)雜空腔組織的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)利用海藻酸鹽可被Ca2＋快速交聯(lián)和GelMA被光照射快速交聯(lián)的特性，初步探討了構(gòu)建復(fù)層空腔組織的可行性。本實(shí)驗(yàn)在生物打印過(guò)程中，首先利用CaCl2快速固化復(fù)合水凝膠中的海藻酸鹽以初步塑型水凝膠，形成空腔結(jié)構(gòu)，而后利用UV照射交聯(lián)GelMA，EDTA洗掉海藻酸鹽后留下GelMA作為細(xì)胞支架材料復(fù)合物。通過(guò)兩次快速交聯(lián)固化水凝膠，可增加一定的力學(xué)強(qiáng)度，以達(dá)到生物打印后快速構(gòu)建復(fù)雜管腔結(jié)構(gòu)的目的。實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)復(fù)合水凝膠可以同時(shí)同步一次性打印出具有不同層次的復(fù)層管狀結(jié)構(gòu)，而兩層亞結(jié)構(gòu)內(nèi)水凝膠或細(xì)胞均固化良好，短期內(nèi)不會(huì)相互滲透。

細(xì)胞與材料具有良好的生物相容性，是構(gòu)建具有生物功能的組織或器官的另一關(guān)鍵因素。增加海藻酸鹽的濃度，將更有利于打印的快速塑形，但是高濃度的海藻酸鹽不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)中，我們將海藻酸鹽的濃度控制在3%以下，而GelMA控制在5%以上，細(xì)胞的活力在打印后可維持在85%以上。但是，由于打印過(guò)程對(duì)細(xì)胞的剪切、擠壓等因素，使得打印后細(xì)胞活力在第2～3天有明顯的降低，該現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]。而短期內(nèi)含有細(xì)胞的復(fù)層管狀結(jié)構(gòu)具有良好的灌注功能，注射的含有顏色的溶液，可以快速通過(guò)管腔結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有滲出到管壁外側(cè)。然而，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期培養(yǎng)（2周以上）時(shí)打印的組織形態(tài)難以維持，力學(xué)強(qiáng)度非常差，理想的打印材料還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，利用GelMA和海藻酸鹽復(fù)合的水凝膠可快速打印具有復(fù)層結(jié)構(gòu)的空腔管狀結(jié)構(gòu)，所打印細(xì)胞具有良好的活性。該結(jié)果為構(gòu)建復(fù)雜空腔組織或器官提供了借鑒，但仍有待于進(jìn)一步的探索。